PEMBURUKAN BAKTERIA: CIRI DAN PENYEDIAAN - BIOLOGI - 2024

The smear bakteria adalah sebuah filem nipis smear daripada penggantungan mikroorganisma bakteria yang dibuat di atas plat kaca telus atau slaid, untuk pemerhatian di bawah mikroskop cahaya.

Peluasan dalam bentuk filem dilakukan untuk memisahkan mikroorganisma sebanyak mungkin, kerana jika dikelompokkan, pengamatan tidak jelas.

Rajah 1. Smear bakteria dilihat di bawah mikroskop elektron imbasan. Sumber: pixbay.com

Dalam kajian kultur bakteria, teknik penyediaan smear, fiksasi dan pewarnaan digunakan untuk menganalisisnya dengan lebih baik. Oleh kerana saiz mikroorganisma yang kecil, penggunaan mikroskop optik semestinya diperlukan untuk pemerhatian mereka.

Mikroskop optik adalah instrumen penting untuk memerhatikan smear. Ini menggunakan lensa optik dan cahaya yang membolehkan melihat sampel dengan pembesaran tinggi.

Secara umum, sel hidup tidak mempunyai struktur yang kebanyakan berwarna, dilihat dengan mikroskop cahaya mereka tidak berwarna, sampel telus, dan mereka menunjukkan kontras dalaman yang sangat sedikit dan dengan persekitarannya.

Pemerhatian dengan mikroskop optik medan terang sederhana, tanpa menggunakan teknik pewarnaan tambahan, sangat terhad dan hanya digunakan dalam beberapa kes, seperti dalam pemerhatian pergerakan mikroorganisma.

Untuk pemerhatian mikroorganisma yang optimum, keseimbangan mesti dicapai antara kontras dan resolusi. Perincian sel tidak dapat dilihat di bawah mikroskop, walaupun dengan resolusi tinggi; Penggunaan pewarna diperlukan melalui teknik pewarnaan, yang memberikan kontras untuk pemerhatian.

Ciri-ciri smear bakteria berkualiti

Kontras yang sangat baik

Untuk mencapai kontras yang sangat baik terdapat mikroskop canggih yang disebut mikroskop kontras fasa, mikroskop gangguan pembezaan, dan mikroskop medan gelap. Jenis mikroskop ini digunakan untuk memerhatikan struktur bakteria seperti sarung dan filamen, antara lain.

Pewarnaan adalah teknik mudah untuk meningkatkan kontras yang dicapai dengan mikroskop medan terang. Dalam teknik ini, noda yang berbeza dapat digunakan, yang meningkatkan pemerhatian mikroskopik dengan ketara.

Noda dilakukan secara langsung pada pelekapan atau pemanjangan penggantungan mikroorganisma pada slaid, yang sebelumnya dikeringkan dan diperbaiki.

Pembaikan yang baik

Fiksasi adalah teknik yang digunakan untuk memelihara struktur sel; menyebabkan ketidakaktifan mikroorganisma dan lekatan pada kaca slaid. Terdapat rawatan penetapan yang berbeza: fiksasi haba dan fiksasi kimia.

Pelekapan haba

Ini adalah kaedah yang paling banyak digunakan untuk memerhatikan smear bakteria. Teknik ini terdiri daripada melepasi suspensi bakteria smear melalui api yang lebih ringan. Teknik ini mampu memelihara morfologi luaran bakteria, tetapi merosakkan struktur dalamannya.

Fiksasi kimia

Fiksasi kimia menggunakan bahan kimia pengawet, seperti formaldehid atau formalin, etanol dan asid asetik, antara lain. Kelebihan menggunakan agen penetapan kimia adalah bahawa pemeliharaan struktur sel mikroorganisma dalaman dicapai.

Gambar 2. Pemburuan darah. Sumber: Bobjgalindo, dari Wikimedia Commons

Pewarnaan yang baik

Prosedur yang paling biasa untuk pewarnaan smear yang telah kering dan tetap adalah pewarnaan positif atau sederhana, pewarnaan berbeza, dan pewarnaan negatif. Terdapat juga teknik khas untuk pewarnaan struktur sel tertentu (kapsul, spora, flagella).

Pewarnaan positif atau pewarnaan sederhana

Pewarnaan positif atau sederhana adalah teknik pewarnaan smear yang paling banyak digunakan. Ia menggunakan pewarna yang memiliki kemampuan untuk mengikat struktur mikroba tertentu, yang memungkinkannya diperhatikan di bawah mikroskop.

Pewarna ini mempunyai kumpulan kromofor (bahagian berwarna) dalam struktur kimianya, dengan ikatan berganda dan ikatan tunggal (konjugasi). Ikatan ini seterusnya dapat mewujudkan ikatan ionik atau kovalen dengan beberapa struktur selular.

Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan positif atau sederhana kebanyakannya merupakan turunan kimia dari anilin (garam organik berwarna).

Sebaliknya, di antara pewarna kita dapat menemui beberapa dengan pH asas dan yang lain dengan pH berasid.

Pewarna asas

Dalam pewarna asas, kumpulan kromofor mempunyai cas elektrik positif. Sebilangan besar mikroorganisma prokariotik mempunyai pH dalaman yang neutral, dan permukaan selnya bercas negatif. Melalui interaksi elektrostatik ini, kromofor mengikat sel dan mengotorkannya.

Contoh pewarna asas adalah metilena biru, kristal ungu, malachite green, asas fuscin, safranin, antara lain.

Pewarna asid

Dalam pewarna asid, kumpulan kromofor mempunyai muatan elektrik negatif. Ini digunakan untuk mengotorkan protein dengan kumpulan amino bermuatan positif. Contoh pewarna asid ialah asid fuscin, rose Bengal, Congo red, dan eosin.

Pewarnaan berbeza

Teknik pewarnaan pembezaan terdiri daripada menerapkan dua pewarna dengan warna atau intensiti yang berbeza, untuk membezakan mikroorganisma yang berbeza di bawah mikroskop. Noda Gram dan noda ketahanan asid-alkohol adalah noda pembezaan yang paling biasa digunakan dalam bakteriologi.

Noda Gram digunakan sebagai ujian awal untuk mengetahui bentuk, ukuran, kumpulan sel, dan juga jenis dinding sel. Dengan menggunakan ujian Gram stain, bakteria dinding sel dikelaskan kepada bakteria Gram positif dan bakteria Gram negatif.

Pewarnaan negatif

Dalam teknik ini, pewarna kimia digunakan yang tidak menembusi bahagian dalam sel, tetapi menjadikan media di mana mikroorganisma muncul sebagai latar belakang hitam.

Dalam teknik pewarnaan negatif, smear dibuat dengan setitik tinta India atau suspensi nigrosin, yang setelah membiarkan pengeringan pada suhu bilik membentuk filem legap ke arah cahaya. Dengan cara ini, mikroorganisma muncul sebagai bentuk terang pada latar belakang gelap.

Penyediaan

A. Pemburuan

1.- Basuh slaid dengan baik, keringkan dengan kertas penyerap dan labelkan. Label mesti menunjukkan kandungan penyediaan, tarikh dan nama orang yang memprosesnya.

2.- Nyalakan lebih ringan dan sterilkan gelung inokulasi dalam api hingga merah terang.

3.- Biarkan pemegangnya sejuk.

4.- Ambil tiub kultur bakteria, lepaskan penutupnya dan cepat keluar mulut tiub berhampiran api pembakar (nyalaan).

5.- Masukkan gelung inokulasi ke dalam tiub yang mengandungi kultur bakteria dan ambil sampelnya.

6.- Jika kultur berada dalam medium cair, letakkan sampel yang diambil dengan pegangan di tengah gelongsor dan sebarkannya dengan hati-hati dalam bulatan berdiameter sekitar 2 cm.

7.- Sterilkan gelung inokulasi sekali lagi.

8.- Biarkan smear kering di udara.

9.- Ulangi langkah 3 hingga 8 tiga kali.

10.- Jika kultur berada dalam medium pejal, setitik air suling mesti diletakkan sebelumnya di atas slaid. Ini dilakukan untuk mencampurkan sampel kecil kultur yang diambil dengan gelung inokulasi, seperti yang diarahkan pada langkah 2 hingga 5 (keadaan aseptik).

11.- Sebarkan sampel yang dicairkan dengan setetes air di slaid dan ulangi tiga kali.

B. Pembetulan

1.- Tambahkan dua tetes metanol atau etanol mutlak ke lapisan kering - dari kultur dalam medium cair -.

2.- Biarkan pengeringan udara jauh dari alat yang lebih ringan.

3.- Jika smear berasal dari kultur dalam medium padat, smear kering diperbaiki dengan panas, menyebarkannya 2 hingga 3 kali dengan cepat melalui bahagian paling panas dari api yang lebih ringan.

4.- Sentuh bahagian bawah smear dengan bahagian punggung tangan kiri (untuk tangan kanan; jika tidak, gunakan tangan kanan) dan sahkan bahawa ia sejuk.

C. Pewarnaan sederhana

1.- Tambahkan 2 tetes noda terpilih ke smear dan biarkan untuk bertindak selama masa yang diperlukan dalam protokol tertentu untuk setiap noda (umumnya antara 1 hingga 5 minit).

2.- Sebilangan noda memerlukan penggunaan haba untuk pengaktifannya, dalam hal ini perlu sangat berhati-hati ketika memanaskan gelangsar dalam api yang lebih ringan (manipulasi dengan pinset dan elakkan mendidih). Panasnya smear boleh memusnahkan sel-sel yang akan diperhatikan.

3.- Keluarkan pewarna yang berlebihan dengan mencuci dengan air suling dari picet. Keluarkan air basuh dengan mengetuk perlahan slaid di pinggirnya, condong ke atas meja kerja.

4.- Benarkan pengeringan udara.

5.- Bergantung pada jenis pemerhatian, selimut digunakan atau tidak pada tahap ini. Selimut melindungi dan memelihara noda. Sekiranya pemerhatian rendaman minyak dibuat pada tahap ini, tidak ada penutup yang digunakan tetapi smear tidak dapat dipelihara.

D. Pemeliharaan smear yang pasti

1.- Rendam smear berturut-turut dalam setiap penyelesaian yang ditunjukkan di bawah, sekurang-kurangnya 5 minit. Tujuan "mandi" ini adalah untuk sepenuhnya menghilangkan noda. Setiap reagen harus dikeringkan dengan teliti sebelum memasukkan smear ke dalam mandi seterusnya.

Urutan mandi penyahhidratan adalah seperti berikut:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Aseton tulen
4. Campuran aseton-xilol 1: 1
5. Xylol

Kemudian biarkan hingga kering.

2.- Pasang selimut, lebih baik 22 × 22 mm, menggunakan balsam Kanada atau media pelekap lain.

Rujukan

1. Briggs, G. (1965). Faktor Penyebab Kemalangan dan Jangkitan Makmal Mikrobiologi. Makmal Biologi Tentera Darat AS. Benteng Detrick.
2. Cappucino, JG dan Welch, CT (2017). Mikrobiologi: Manual Makmal. Pearson.
3. Holt, Penyunting JG. (1977). Manual Bergey yang lebih pendek untuk Bakteriologi Penentu. Baltimore ^ke- 8 : The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR dan Kes; CL (2018). Eksperimen Makmal dalam Mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Mikrobiologi Diagnostik. 14 ^th St. Louis, Amerika Syarikat: Elsiever, Inc.