IMUNOFLUORESENSI: RASIONAL, PROTOKOL, DAN APLIKASI - BIOLOGI - 2025

The immunofluorescence adalah satu teknik yang kuat immunostaining menggunakan antibodi kovalen terikat kepada molekul pendarfluor untuk mengenal pasti sasaran tertentu dalam sampel sel tetap ke sokongan yang kukuh.

Teknik ini melibatkan pemerhatian mikroskopik dengan kekhususan imunologi, memungkinkan untuk memerhatikan sel-sel hidup atau mati yang dapat menunjukkan jumlah antigen yang sangat kecil. Ia digunakan secara meluas dalam bidang penyelidikan dan diagnosis klinikal pelbagai patologi.

Imunolabel pelabelan filamen aktin dalam sel kardiomiosit (Sumber: Ps1415 melalui Wikimedia Commons)

Teknik ini, terutama kualitatif (dengan beberapa varian kuantitatif), berkaitan dengan visualisasi sampel dengan isyarat produk fluorophore, yang merupakan molekul pendarfluor yang terikat dengan antibodi dan yang mampu bersemangat pada panjang gelombang tertentu .

Dalam konteks selular sangat berguna untuk mengkaji kehadiran / ketiadaan dan lokasi subselular protein. Teknik ini awalnya digunakan dalam pengaturan klinikal untuk diagnosis virus seperti influenza dan kemudian untuk banyak penyakit berjangkit lain.

Ini adalah teknik yang sangat sensitif, dan dengan peralatan mikroskopi yang sesuai, ia dapat mempunyai resolusi yang sangat baik. Ia memerlukan, untuk pemerhatiannya, penggunaan mikroskop confocal atau epifluoresensi.

Namun, walaupun sangat popular, ia dapat menghadirkan beberapa masalah penting sehubungan dengan memperoleh pendarfluor tidak spesifik yang menghasilkan beberapa "kebisingan" latar belakang, yang sering membatasi pembacaan hasil yang mencukupi.

Asas

Imunofluoresensi didasarkan pada eksploitasi fenomena biologi reaksi interaksi antara antibodi dan antigen. Ini berkaitan secara khusus dengan visualisasi atau pengesanan reaksi ini dengan molekul pendarfluor yang menarik hingga panjang gelombang tertentu.

Antibodi adalah protein imunoglobulin yang dirembeskan dari sel B aktif, yang dihasilkan secara khusus terhadap antigen, yang dapat mengikatnya dengan pertalian dan kekhususan yang besar. Imunofluoresensi menggunakan imunoglobulin IgG, yang didapati larut dalam serum darah.

Antibodi adalah molekul hingga 950 kDa yang terdiri dari dua rantai peptida (berat) pendek (ringan) dan dua panjang "berat" Y. Kedua-dua rantai ringan dan berat dibahagikan kepada dua domain: satu pemboleh ubah, yang dapat mengenali antigen, dan yang lain tetap atau terpelihara, ciri setiap spesies.

Antigen secara fungsional didefinisikan sebagai molekul yang dapat dikenali oleh antibodi dan, sebahagian besarnya, protein. Apabila haiwan terkena antigen, limfosit sistem kekebalan tubuh diaktifkan, menghasilkan antibodi khusus terhadapnya dan berfungsi sebagai sistem pertahanan.

Antigen, seperti protein, misalnya, mungkin mempunyai lebih dari satu epitop atau lokasi pengenalan oleh antibodi, sehingga serum haiwan yang terdedah kepada antigen mungkin mempunyai antibodi poliklonal terhadap kawasan yang berlainan dari protein yang sama.

Oleh itu, imunofluoresensi memanfaatkan kemampuan haiwan untuk menghasilkan antibodi poliklonal terhadap antigen tertentu untuk membersihkannya dan kemudian menggunakannya untuk mengesan antigen yang sama dalam konteks lain.

Antara pewarna atau molekul pendarfluor yang paling banyak digunakan untuk beberapa teknik imunofluoresen adalah fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 and 6 (TRITC), banyak sianin seperti Cy2, Cy3, Cy5 dan Cy7 dan pewarna yang disebut Alexa Fluor® , seperti Alexa Fluor®448.

Protokol

Protokol imunofluoresensi berbeza-beza bergantung pada banyak faktor, namun, secara umum, merangkumi urutan linear langkah-langkah yang terdiri dari:

• Penyediaan plat dan sel
• Pembetulan sampel
• Permeabilisasi
• Menyekat
• Imunostaining atau immunostaining
• Perhimpunan dan pemerhatian

-Penyediaan

Daripada sampel

Penyediaan sampel akan bergantung pada sifatnya dan jenis pengalaman yang akan dijalankan. Kes paling mudah, yang melibatkan penggunaan sel dalam penggantungan, akan dijelaskan di bawah.

Sel dalam suspensi, iaitu, dalam medium kultur cair, pertama-tama mesti dipisahkan darinya dengan sentrifugasi dan kemudian mesti dicuci dengan larutan penyangga atau "buffer" isosmotik, yang mengekalkan integriti mereka.

Biasanya, penyangga fosfat-garam yang dikenal sebagai PBS digunakan, di mana sel-sel disusukan semula dan campuran ini disentrifugasi lagi untuk mendapatkan sel-sel bebas dari media kultur, yang mungkin mengandungi bahan-bahan yang mengganggu.

Daripada bilah

Slaid yang digunakan untuk pemerhatian mikroskopik, di mana sel-sel kemudian akan diperbaiki untuk rawatan hilir yang sesuai, juga mesti disediakan dengan teliti.

Ini ditutup atau "peka" dengan larutan poli-lisin, polimer sintetik yang akan bertindak sebagai "gam molekul" antara sel dan sokongan pepejal, berkat interaksi elektrostatik antara cas positif kumpulan amino mereka dan cas negatif pada protein yang melapisi sel.

Pembetulan sampel

Proses ini terdiri daripada melumpuhkan protein yang terdapat di dalam sel untuk memastikan lokasi ruang mereka tetap utuh. Molekul yang digunakan mestilah mampu melintasi semua jenis membran sel dan membentuk kisi dengan protein kovalen.

Formaldehid dan paraformaldehid, glutaraldehid dan bahkan metanol digunakan secara meluas, dengan mana sampel sel diinkubasi untuk waktu tertentu dan kemudian dicuci dengan larutan penampan isosmotik.

Setelah membetulkan sel, sel-sel tersebut terus dilekatkan pada kepingan yang sebelumnya disensasikan dengan poli-lisin.

Permeabilisasi

Bergantung pada jenis ujian yang dijalankan, perlu untuk menembusi sel yang dikaji atau tidak. Sekiranya yang dicari adalah mengetahui lokasi, kehadiran atau ketiadaan protein tertentu di permukaan sel, permeabilisasi tidak diperlukan.

Sebaliknya, jika anda ingin mengetahui lokasi protein di dalam sel, permeabilisasi adalah mustahak dan akan terdiri daripada menginkubasi sampel dengan Triton X-100, detergen yang mampu menembusi membran sel.

Menyekat

Langkah asas dalam semua teknik imunologi adalah menyekat. Pada tahap prosedur ini, penyekat merangkumi meliputi, pada lembaran peka, semua tapak dengan molekul poli-lisin yang tidak dipatuhi sel. Iaitu, mencegah penyatuan yang tidak spesifik.

Biasanya untuk penyekat larutan dengan albumin serum bovine (BSA) dalam PBS buffer digunakan dan hasil terbaik diperoleh semakin lama masa inkubasi dengan larutan ini. Selepas setiap langkah, termasuk menyekat, perlu membersihkan penyelesaian yang tinggal.

Imunostaining atau immunostaining

Prosedur imunostaining atau immunostaining akan bergantung terutamanya pada apakah itu imunofluoresensi langsung atau tidak langsung (lihat di bawah).

Sekiranya ia adalah imunofluoresensi primer atau langsung, sampel akan diinkubasi dengan antibodi yang diinginkan, yang mesti digabungkan dengan pewarna pendarfluor. Prosedur inkubasi terdiri dari pencairan antibodi dalam larutan yang juga akan mengandungi BSA tetapi dalam perkadaran yang lebih rendah.

Apabila kes itu adalah imunofluoresensi sekunder atau tidak langsung, dua inkubasi berturut-turut harus dilakukan. Pertama dengan antibodi yang diingini dan kemudian dengan antibodi yang mampu mengesan kawasan tetap imunoglobulin primer. Antibodi sekunder inilah yang terikat secara kovalen ke fluorophores.

Teknik ini sangat serba boleh, memungkinkan pelabelan serentak lebih dari satu antigen setiap sampel, selagi ada antibodi primer yang digabungkan dengan fluorofor yang berlainan, dalam hal imunofluoresensi langsung.

Untuk pelabelan serentak dalam imunofluoresensi tidak langsung, perlu memastikan bahawa setiap antibodi primer dihasilkan pada haiwan yang berbeza, dan juga bahawa setiap antibodi sekunder digabungkan dengan fluorofor yang berbeza.

Seperti menyekat, pengeraman dengan antibodi memberikan hasil yang lebih baik lebih lama masa ini. Selepas setiap langkah, perlu membersihkan lebih banyak antibodi yang tidak terikat pada sampel dan pada imunofluoresensi sekunder, perlu disekat sebelum menambahkan antibodi sekunder.

Teknik tertentu menggunakan noda lain yang tidak berkaitan dengan pewarnaan imun, seperti pewarnaan DNA nuklear dengan fluorophore DAPI.

Perhimpunan dan pemerhatian

Semasa masa inkubasi terakhir dengan fluorofor adalah perlu bahawa sampel tetap gelap. Untuk pemerhatian di bawah mikroskop, adalah biasa untuk menggunakan beberapa bahan untuk memelihara pendarfluor fluorofores yang digabungkan dengan antibodi.

Jenis-Jenis

Ringkasan grafik imunofluoresensi langsung dan tidak langsung (Sumber: Westhayl618 melalui Wikimedia Commons)

Imunofluoresensi langsung atau primer

Ini berkaitan dengan pengesanan antigen melalui penggunaan antibodi pendarfluor. Kelebihan utama menggunakan teknik ini adalah kepantasannya, bagaimanapun, banyak kes pengikatan tidak spesifik dapat terjadi dalam proses tersebut, terutama ketika mempelajari sera manusia, kerana mereka kaya dengan antibodi yang sangat heterogen.

Imunofluoresensi tidak langsung atau sekunder

Ia juga dikenali sebagai teknik "sandwic" dan ini melibatkan pengembangan teknik dalam dua langkah. Yang pertama berkaitan dengan penggunaan antibodi bukan pendarfluor dan pengikatannya dengan antigen yang diminati.

Terhadap kawasan tetap antibodi pertama ini (yang sekarang akan berfungsi sebagai antigen) antibodi kedua yang mampu mengenalinya digunakan, yang dikaitkan dengan molekul pendarfluor.

Kemunculan isyarat pendarfluor akan menjadi hasil pengiktirafan khusus antara antibodi bukan pendarfluor pertama dan antigen yang diminati; kehadiran antibodi pertama ini adalah keadaan kedua, yang berlabel dan berkat keberadaan atau ketiadaan antigen dapat ditentukan.

Walaupun teknik yang lebih memakan masa daripada imunofluoresensi langsung (kerana ia merangkumi satu langkah pengeraman lagi), teknik ini tidak melibatkan reka bentuk antibodi pendarfluor untuk setiap antigen yang dikaji, yang menghasilkan, dari segi ekonomi, lebih berdaya maju.

Lebih jauh lagi, ini adalah teknik yang lebih sensitif dari segi penguatan isyarat, kerana lebih dari satu antibodi sekunder dapat mengikat ke kawasan tetap dari antibodi primer, sehingga meningkatkan intensitas isyarat pendarfluor.

Permohonan

Seperti yang telah diperhatikan sebelumnya, imunofluoresensi adalah teknik yang sangat serba boleh, yang telah digunakan dalam banyak cara dalam bidang ilmiah dan klinikal. Ia dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan ekologi, genetik, dan fisiologi mengenai banyak organisma.

Di antara aplikasi klinikal, ia digunakan untuk diagnosis langsung beberapa penyakit dermatologi, sama ada menggunakan imunofluoresensi langsung atau tidak langsung pada tisu epitel pesakit yang dikaji.

Teknik imunofluoresensi telah tersedia dalam organisma uniselular seperti ragi untuk memvisualisasikan mikrotubulus intranuklear dan sitoplasma, aktin dan protein yang berkaitan, filamen 10nm, dan konstituen lain dari sitoplasma, membran, dan dinding sel.

Rujukan

1. Protokol Abcam, Immunocytochemistry dan immunofluorescence. Diperolehi dari abcam.com
2. Greph, C. (2012). Pewarna pendarfluor. Diperolehi dari leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Mikroskopi Imunofluoresen. Dalam Kaedah dalam Biologi Sel (Jilid 48, hlm. 365–394). Akademik Akhbar, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Teknik Imunofluoresensi. Jurnal Dermatologi Penyiasatan, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Kaedah imunofluoresensi untuk ragi. Dalam Kaedah Enzimologi (Jilid 194, hlm. 565-602). Akademik Akhbar, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Aplikasi imunofluoresensi dalam Virologi Kesihatan Awam. Ulasan Bakteriologi, 28 (4), 402-408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Imunofluoresensi dalam penyelidikan fitoplankton: aplikasi dan potensi. J: Phycol. , 32, 1–16.