DNA REKOMBINAN: TEKNIK, APLIKASI DAN ASAS - BIOLOGI - 2026

The DNA rekombinan (rDNA atau rDNA) adalah molekul asid nukleik tiruan dicipta di dalam makmal, dengan mengintegrasikan dua segmen pertubuhan faedah. Ia juga dikenali sebagai DNA chimeric, berkat sifat hibridnya. DNA jenis ini tidak terdapat di alam semula jadi.

Metodologi asas untuk menghasilkannya meliputi: (a) pemilihan DNA sasaran, dan penyisipannya ke dalam serpihan DNA yang lain (umumnya plasmid bakteria); (b) pengenalan plasmid ini ke dalam bakteria, (c) pemilihan bakteria dengan menggunakan antibiotik dan akhirnya (d) ekspresi gen.

Sumber: pixabay.com

Teknik ini memanfaatkan sekumpulan enzim yang memungkinkan untuk menyalin dan menampal serpihan DNA tertentu mengikut penilaian penyelidik.

Matlamat teknologi rekombinan adalah, dalam kebanyakan kes, ekspresi protein (dikenali sebagai protein rekombinan) yang diinginkan oleh ahli biologi molekul untuk penyelidikan masa depan atau untuk membuat protein yang bernilai komersial dan terapeutik - seperti insulin manusia, sebagai contoh.

Asas teknik DNA rekombinan dan penggunaannya dalam kejuruteraan genetik

Dogma pusat biologi molekul

Semua makhluk organik yang kita tahu mempunyai beberapa ciri. Salah satunya adalah sifat bahan genetik dan cara protein dibuat - suatu proses yang dikenali sebagai "dogma" pusat biologi molekul.

Dengan pengecualian beberapa virus, semua organisma menyimpan maklumat genetik dalam DNA (asid deoksiribonukleik), yang dikumpulkan dengan cara yang sangat padat dan teratur dalam inti sel.

Untuk ekspresi gen, molekul DNA ditranskripsikan ke dalam RNA messenger, dan yang terakhir diterjemahkan ke dalam bahasa asid amino, blok protein.

Apakah DNA rekombinan?

Antara tahun 1970-an dan 1980-an, ahli biologi molekul mula memanfaatkan proses yang secara semula jadi berlaku di dalam sel dan dapat mengekstrapolasi mereka ke makmal.

Dengan cara ini, gen asal haiwan (vertebrata, misalnya) dapat dimasukkan ke dalam segmen DNA dari bakteria; atau DNA bakteria dapat digabungkan dengan DNA virus. Oleh itu, kita dapat menentukan DNA rekombinan sebagai molekul yang terdiri daripada DNA dari dua organisma yang berbeza.

Setelah molekul hibrid atau rekombinan ini dibuat, gen minat akan dinyatakan. Dengan ungkapan kata kita ingin merujuk kepada proses terjemahan ke protein.

Enzim sekatan dan ligase: kunci proses

Elemen utama dalam mengembangkan teknologi DNA rekombinan adalah penemuan enzim sekatan.

Ini adalah molekul protein yang menunjukkan kemampuan untuk memecah DNA (nuklease) ke dalam urutan tertentu, berfungsi sebagai "gunting molekul". Fragmen yang dihasilkan oleh enzim ini disebut pecahan sekatan.

Enzim tersebut boleh menghasilkan pemotongan simetri dalam urutan sasaran (di kedua rantai pada ketinggian yang sama) atau pemotongan asimetrik. Aspek utama tindakan enzim sekatan adalah bahawa selepas pembelahan rantai, "tepi longgar" diperoleh, pelengkap tepi lain yang dipotong oleh enzim yang sama.

Beberapa contoh adalah ECOR 1 dan Sma 1. Pada masa ini lebih daripada 200 jenis enzim sekatan diketahui dan tersedia secara komersial.

Agar bermanfaat, gunting mesti disertakan dengan gam. Tindakan penyegelan DNA ini (sebelumnya dirawat dengan enzim sekatan) dilakukan oleh ligase.

Teknik: bagaimana DNA organisma diubahsuai secara buatan di makmal?

Di bawah ini kami akan menerangkan langkah-langkah utama yang diperlukan oleh teknologi DNA rekombinan. Semua dilakukan oleh profesional di makmal biologi molekul.

Apa itu "klon"?

Sebelum meneruskan protokol eksperimen, kita harus perhatikan bahawa dalam biologi molekul dan bioteknologi istilah "klon" dan kata kerja "klon" banyak digunakan. Ini boleh menyebabkan kekeliruan.

Dalam konteks ini, kita tidak merujuk kepada pengklonan seluruh organisme (seperti contohnya domba Dolly yang terkenal), tetapi pada pengklonan sekeping DNA, yang dapat menjadi gen. Maksudnya, menghasilkan banyak salinan - genetik serupa - urutan.

1. Pengasingan dan pengambilan DNA

Langkah pertama adalah menentukan urutan mana yang ingin anda gunakan. Ini bergantung sepenuhnya kepada penyelidik dan objektif karyanya. DNA ini kemudiannya mesti diasingkan dan disucikan. Kaedah dan prosedur untuk mencapai ini bergantung pada badan dan tisu.

Secara amnya, sekeping tisu diambil dan menjalani rawatan dalam buffer lisis dengan proteinase K (enzim proteolitik) dan kemudian DNA diekstrak. Selepas itu, bahan genetik dipecah menjadi serpihan kecil.

2. Vektor pengklonan

Selepas langkah-langkah persediaan, penyelidik berusaha untuk memperkenalkan segmen DNA yang menarik ke dalam vektor pengklonan. Mulai sekarang kita akan memanggil segmen DNA ini DNA putih.

Plasmid

Salah satu vektor yang paling banyak digunakan dalam plasmid asal bakteria. Plasmid adalah molekul DNA dua helai bulat yang dijumpai secara semula jadi dalam bakteria. Mereka asing dengan kromosom bakteria - iaitu, ia adalah ekstrakromosom, dan dijumpai secara semula jadi di prokariota ini.

Elemen asas vektor adalah: (a) asal replikasi, yang memungkinkan sintesis DNA; (b) agen pemilihan, yang memungkinkan untuk mengenal pasti organisma yang membawa plasmid dengan DNA sasaran, seperti ketahanan terhadap beberapa antibiotik; dan (c) laman berbilang panggilan, di mana urutan yang akan dikenali oleh enzim sekatan dijumpai.

DNA rekombinan pertama yang berjaya di makmal diklon ke dalam plasmid pSC101 dari bakteria E. coli. Ini berisi laman larangan untuk enzim pembatasan EcoRI dan gen untuk tahan terhadap antibiotik, selain asal replikasi.

Penyisipan DNA sasaran dalam plasmid dilakukan dengan menggunakan alat molekul enzim sekatan dan ligase yang dijelaskan dalam bahagian sebelumnya.

Jenis vektor yang masih ada

Selain plasmid, DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor lain, seperti bakteriofag lambda, kosmid, YAC (kromosom tiruan ragi), BAC (kromosom tiruan bakteria), dan fagemid.

3. Pengenalan DNA rekombinan

Setelah molekul DNA rekombinan (gen yang berminat dalam plasmid atau vektor lain) diperoleh, ia dimasukkan ke dalam organisma tuan rumah atau inang, yang boleh menjadi bakteria.

Untuk memperkenalkan DNA asing ke dalam bakteria, teknik yang disebut transformasi bakteria digunakan, di mana organisme menjalani perawatan dengan kation divalen yang membuatnya rentan untuk mengambil DNA.

Secara metodologi, kita tidak dapat menjamin bahawa 100% bakteria dalam budaya kita telah berkesan mengambil molekul DNA rekombinan kita. Di sinilah bahagian plasmid yang mengandungi ketahanan terhadap antibiotik dimainkan.

Oleh itu, bakteria yang telah mengambil plasmid akan tahan terhadap antibiotik tertentu. Untuk memilihnya, cukup untuk menggunakan antibiotik tersebut dan mengambil mangsa yang selamat.

4. "Tuai" protein

Setelah memilih bakteria dengan DNA rekombinan kami, kami terus menggunakan mesin enzimatik tuan rumah untuk menghasilkan produk protein yang diminati. Semasa bakteria membiak, plasmid diturunkan ke keturunannya, sehingga tidak hilang semasa pembelahan.

Prosedur ini menggunakan bakteria sebagai sejenis "kilang" protein. Kemudian kita akan melihat bahawa ini adalah prosedur yang sangat relevan dalam pengembangan rawatan perubatan yang berkesan.

Setelah kultur siap dan bakteria menghasilkan sejumlah besar protein, sel tersebut akan dilenyapkan atau terganggu. Terdapat pelbagai teknik biokimia yang memungkinkan pemurnian protein mengikut ciri fizikokimia mereka.

Dalam konteks eksperimen lain, kita mungkin tidak berminat untuk menghasilkan protein, tetapi kita berminat untuk mendapatkan urutan DNA itu sendiri. Sekiranya ini terjadi, plasmid akan digunakan untuk membuat beberapa salinan pecahan kepentingan agar cukup DNA sasaran untuk melakukan eksperimen yang relevan.

Permohonan

Teknologi DNA rekombinan membuka banyak kemungkinan dalam biologi molekul, bioteknologi, perubatan, dan bidang lain yang berkaitan. Aplikasi yang paling baik adalah yang berikut.

Analisis genetik

Aplikasi pertama berkaitan secara langsung dengan makmal biologi molekul. Teknologi DNA rekombinan membolehkan para penyelidik memahami fungsi normal gen, dan protein yang dihasilkan dapat digunakan dalam penyelidikan lebih lanjut.

Industri farmaseutikal

Protein yang dihasilkan menggunakan prosedur DNA rekombinan mempunyai aplikasi dalam perubatan. Dua contoh yang sangat relevan di lapangan adalah insulin manusia dan hormon pertumbuhan, yang digunakan pada pesakit yang kekurangan protein ini.

Terima kasih kepada DNA rekombinan, protein ini dapat dihasilkan tanpa perlu mengeluarkannya dari manusia lain, yang menunjukkan komplikasi metodologi tambahan dan risiko kesihatan. Ini telah membantu meningkatkan kualiti hidup pesakit yang tidak terkira banyaknya.

Rujukan

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologi 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Sel: pendekatan molekul (Jilid 10). Washington, DC: Akhbar ASM.
3. Devlin, TM (2004). Biokimia: buku teks dengan aplikasi klinikal. Saya terbalik.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Peranan Teknologi DNA Rekombinan untuk Meningkatkan Kehidupan. Jurnal genomik antarabangsa, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Anatomi patologi. Elsevier Sepanyol.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Pengenalan mikrobiologi. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Insulin manusia: ubat pertama teknologi DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.