PENIMBAL FOSFAT (PBS): RASIONAL, PENYEDIAAN DAN PENGGUNAANNYA - BIOLOGI - 2026

The buffer fosfat, fosfat Buffered masin atau BPS merupakan pemampan isotonik, yang berfungsi untuk mengekalkan pH dan tekanan osmosis seperti yang dekat dengan persekitaran biologi semula jadi (fisiologi). Akronim PBS bermaksud salin buffer fosfat.

PH dan osmolariti adalah dua aspek yang sangat penting yang mesti dikawal dalam protokol makmal tertentu. Dalam hal pH, sangat penting untuk dikendalikan, terutama dalam reaksi biokimia, kerana ini mungkin berbeza atau tidak dilakukan jika reaktan berada pada pH yang tidak sesuai.

Garam garam fosfat PBS pada dua pH yang berbeza. Sumber: Pixinio.com

Sementara itu, pengawalan osmolariti sangat penting terutama ketika bekerja dengan sel hidup, kerana membran plasma sel bertindak balas sesuai dengan kepekatan zat terlarut di mana ia dijumpai.

Sekiranya sel-sel dipindahkan ke media hipertonik mereka akan menjadi dehidrasi, kerana kecerunan air akan dibawa ke sisi di mana terdapat kepekatan zat terlarut yang lebih tinggi. Sekiranya, sebaliknya, sel-sel diletakkan dalam medium hipotonik, sel-sel akan menyerap cairan sehingga dilenyapkan.

Itulah sebabnya penyangga PBS digunakan untuk protokol makmal yang memerlukan pemeliharaan sel secara in vitro, dengan cara ini sel tidak akan rosak.

PBS terdiri dari kombinasi garam, seperti natrium klorida, natrium fosfat, kalium klorida, dan kalium fosfat. Komposisi PBS boleh berbeza-beza bergantung pada protokol.

Asas

Pada dasarnya fungsi penyangga fosfat adalah untuk mengekalkan pH fisiologi yang tetap bersama dengan kepekatan elektrolit yang serupa dengan yang terdapat di dalam badan.

Dalam persekitaran ini, sel dapat tetap stabil, kerana keadaan fisiologi disimulasikan sebanyak mungkin.

Sebatian lain boleh ditambahkan ke dalam formulasi PBS asli jika perlu, sebagai contoh penambahan EDTA ke penyangga berguna untuk mencuci sel darah merah dalam ujian ketidaksesuaian silang.

EDTA mencegah pecahan pelengkap C1 yang terdapat di dalam serum daripada dibelah dan dilenyapkan ke sel darah merah, iaitu, ia mengelakkan hasil ketidaksesuaian yang salah. Di samping itu, EDTA membantu mengasingkan sel.

Penyediaan

Kuantiti garam yang mesti ditimbang untuk penyediaan garam buffer fosfat PBS akan bergantung pada kuantiti yang perlu disediakan:

-Penyelesaian stok garam larutan fosfat (10X PBS)

Untuk satu liter penyelesaian:

Untuk menimbang:

80.6 g NaCl,

2.2 g KCl,

11.5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2.0 g KH ₂ HPO ₄

Teknik penyediaan

Masukkan garam berat ke dalam bikar, tambahkan air secukupnya (80%) dan campurkan di atas piring pengadun dengan magnet bar sehingga garam larut.

Penyediaan PBS menggunakan plat pengadun dengan magnet bar. Sumber: Pengguna: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Tapis untuk membuang zarah yang tidak larut. Gunakan penapis dengan pori 0,45 µm. Autoklaf dan sebarkan secara aseptik dalam tudung aliran lamina di balang kaca dengan penutup.

Penyelesaian 10X (pekat) tidak menyesuaikan pH. Penyesuaian dibuat sekali diencerkan ke kepekatan buffer PBS 1X, (pencairan 1:10).

-Berat garam fosfat (1X PBS)

1X PBS boleh disediakan secara langsung, dengan menimbang jumlah garam yang sesuai, atau boleh disediakan dengan mencairkan larutan stok (1:10) dengan air suling steril.

-Untuk menyediakan satu liter garam larutan fosfat 1X PBS secara langsung, timbang:

8.06 g NaCl,

0.22 g KCl,

1.15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0.20 g KH ₂ HPO ₄

Teknik penyediaan

Teruskan seperti yang dijelaskan dalam larutan pekat. Selepas itu, pH mesti disesuaikan. Untuk melakukan ini, ukur pH dan bergantung pada hasilnya, gunakan asid (HCl) atau basa (NaOH) untuk menurunkan atau menaikkan pH masing-masing yang diperlukan, sehingga mencapai 7.4.

Asid atau basa ditambahkan secara bertahap sambil memantau nilai pH larutan menggunakan pH meter. Tapiskan, autoklaf, dan sebarkan secara aseptik ke dalam tiub kon atau balang yang diperlukan.

-Untuk menyediakan 1X PBS dari penyelesaian stok 10X:

Buat pencairan 1:10. Sebagai contoh, untuk menyediakan 1 liter 1X PBS, ukur 100 ml larutan stok dan tambahkan 700 ml air suling steril. Selaraskan pH dan isi jumlah air hingga 1000 ml.

Penyangga PBS yang disediakan tidak berwarna dan jelas.

PBS setiap hari boleh disimpan pada suhu bilik dan selebihnya di dalam peti sejuk.

Penyelesaian untuk penyesuaian pH

HCl

Untuk 100 ml HCL 1 molar (asid hidroklorik).

Ukur 91 mL air suling dan letakkan di dalam bikar 250 mL.

Ukur 8.62 mL HCl pekat dan perlahan-lahan tambahkannya ke dalam bikar yang berisi air (jangan lakukan sebaliknya). Ambil langkah keselamatan yang sesuai semasa mengendalikan asid kuat (bahan yang sangat menghakis).

Campurkan selama 5 minit lebih baik menggunakan piring pengadun dengan batang magnet di dalam gelas. Pindahkan ke termos 100 ml dan isikan hingga 100 ml dengan H ₂ O suling.

NaOH

Untuk 100 ml NaOH (natrium hidroksida) 10 molar.

Ukur 40 mL air suling dan letakkan di dalam bikar 250 mL. Ukur 40 g NaOH dan tambahkan ke dalam air. Campurkan menggunakan piring pengadun dengan batang magnet di dalam gelas.

Pindahkan ke dalam labu volumetrik 100 ml dan isikan hingga bekas dengan air suling. Mematuhi peraturan biosafety, kerana reaksi ini bersifat eksotermik (ia membebaskan tenaga dalam bentuk panas).

Sekiranya anda ingin menyediakan larutan garam fosfat dalam jumlah yang lain, anda boleh melihat jadual berikut:

Sumber: «Makmal Genomik Viral dan Manusia, UASLP School of Medicine»

Permohonan

Ia digunakan terutamanya dalam makmal biologi sel, imunologi, imunohistokimia, bakteriologi, virologi, dan penyelidikan.

Ia sangat sesuai untuk mencuci sel dengan sentrifugasi (sel darah merah), pencucian monolayer sel, dalam teknik elipsometri spektroskopi, dalam pengukuran biofilm bakteria, dalam pemeliharaan kultur sel untuk virus, sebagai penyelesaian pencucian dalam teknik imunofluoresensi tidak langsung. dan dalam teknik pencirian antibodi monoklonal.

Ia juga digunakan untuk mengangkut sel atau tisu, sebagai pengencer untuk penghitungan sel, penyediaan enzim selular (trypsin), sebagai pengencer untuk kaedah pengeringan biomolekul dan untuk menyiapkan reagen lain.

Sebaliknya, Martin et al. Pada tahun 2006 menunjukkan bahawa PBS berguna di makmal sains forensik, khususnya dalam pemulihan sperma dari smear faraj, atau dalam pemulihan sel-sel vagina dari smear zakar. Dengan cara ini dapat dibentuk sekiranya ada hubungan seksual.

Batasan

-Beberapa buffer PBS mengandungi bahan yang disebut sodium azide sebagai pengawet. Sebatian ini boleh menghasilkan bahan letupan jika bersentuhan dengan plumbum atau tembaga. Atas sebab ini, perhatian khusus mesti diambil semasa membuang reagen ini ke longkang. Sekiranya dibuang dengan cara ini, air yang banyak mesti ditambahkan untuk mencairkannya secara maksimum.

-Zink tidak boleh ditambahkan ke dalam buffer fosfat, kerana menyebabkan beberapa garam mendakan.

-Wangen et al. Pada tahun 2018 menentukan bahawa penggunaan PBS tidak sesuai untuk mencuci sel leukemia myeloid akut primer (AML) yang diekstrak dari darah periferal, kerana fakta bahawa banyak sel hilang oleh lisis, dengan penurunan bahan yang besar protein.

Oleh itu, mereka menentukan bahawa sel AML primer tidak boleh dicuci dengan PBS setelah disimpan dalam nitrogen cair.

Rujukan

1. Coll J. (1993). Teknik diagnostik dalam virologi. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Kultur sel. Perubahan Medium. Jabatan Sitologi Normal dan Patologi dan Histologi Universiti Seville. Terdapat di personal.us.es
3. Penyediaan Salin Buffered Fosfat (PBS). (2008). Prosedur Operasi Standard (SOP) Makmal Genomik Manusia dan Viral UASLP School of Medicine. Terdapat di: genomica.uaslp.mx
4. "Salin Penyangga Fosfat." Wikipedia, Ensiklopedia Percuma. 3 Apr 2019, 19:36 UTC. 13 Apr 2019, 02:57 id.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Topik dalam biofizik molekul. Terdapat di: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manual. PBS + EDTA. Terdapat di: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Penggunaan garam buffer fosfat untuk pemulihan sel dan spermatozoa dari swab. Sains Keadilan. 2006; 46 (3): 179-84. Terdapat dalam: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Kaedah Pemeliharaan dan Pencucian Salin Buffered Fosfat Mempengaruhi Proteome Leukemia Myeloid Akut. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Terdapat dalam: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Asas teori dan praktikal histokimia. Majlis Penyelidikan Ilmiah atasan. Madrid. Terdapat di: books.google.co.ve