SITOKIMIA: SEJARAH, OBJEK KAJIAN, UTILITI DAN TEKNIK - BIOLOGI - 2025

The cytochemistry terdiri daripada satu siri teknik yang bergantung kepada pengenalpastian dan pelupusan bahan tertentu di dalam sel. Ia dianggap sebagai cabang biologi sel yang menggabungkan morfologi sel dengan struktur kimia.

Menurut Bensley, pengasas aplikasi sitologi moden, menyatakan bahawa tujuan sitokimia adalah untuk menemui organisasi kimia sel untuk memahami misteri kehidupan. Serta mengkaji perubahan dinamik yang berlaku semasa peringkat fungsional yang berbeza.

1: Penyakit ekstremammary Paget. (Hematoxylin-Eosin) 2: plak pikun yang diamati di korteks serebrum pada pesakit dengan penyakit Alzheimer. (Impregnasi perak) 3: Lidah arnab, serat kolagen (biru). Serat otot (jalur ungu). (Trichrome Masson). 4: Tisu hati dengan degenerasi lemak. (Sudan III) 5: Hati yang meradang. Nekrosis. (Toluidine blue) Sumber: Wikipedia. com / Pengguna: KGH / Fail Domain Awam / Mohit Lalwani

Dengan cara ini, adalah mungkin untuk menentukan peranan metabolik yang dimainkan oleh bahan-bahan ini di dalam sel.

Sitokimia menggunakan dua kaedah utama. Yang pertama berdasarkan prosedur kimia dan fizikal. Teknik-teknik ini menggunakan mikroskop sebagai alat yang sangat diperlukan untuk memvisualisasikan reaksi kimia yang berlaku pada bahan-bahan tertentu di dalam sel.

Contoh: penggunaan pewarna sitokimia, seperti reaksi Feulgen atau reaksi PAS, antara lain.

Kaedah kedua adalah berdasarkan biokimia dan mikrokimia. Dengan metodologi ini dapat menentukan secara kuantitatif kehadiran bahan kimia intraselular.

Antara bahan yang dapat dinyatakan dalam struktur tisu atau sel adalah seperti berikut: protein, asid nukleik, polisakarida dan lipid.

Sejarah sitokimia

Teknik sitokimia sejak penemuannya telah membantu memahami komposisi sel, dan lama-kelamaan pelbagai teknik telah muncul yang menggunakan pelbagai jenis pewarna dengan pertalian dan asas yang berbeza.

Selepas itu, sitokimia membuka cakrawala baru dengan penggunaan substrat tertentu untuk menunjukkan keberadaan enzim atau molekul lain dalam sel secara kolorimetrik.

Begitu juga, teknik-teknik lain telah muncul seperti imunokitokimia yang sangat membantu dalam diagnosis banyak penyakit. Immunocytochemistry didasarkan pada reaksi antigen-antibodi.

Sebaliknya, sitokimia juga menggunakan bahan pendarfluor yang disebut fluorokrom, yang merupakan penanda yang sangat baik untuk mengesan struktur sel tertentu. Oleh kerana ciri-ciri fluorokrom, ia menyoroti struktur yang dilekatkannya.

Apa yang awak belajar?

Pelbagai teknik sitokimia yang digunakan pada sampel biologi mempunyai persamaan: mereka mendedahkan adanya jenis bahan tertentu dan mengetahui lokasinya dalam struktur biologi yang sedang dalam penilaian, sama ada jenis sel atau tisu.

Bahan ini boleh berupa enzim, logam berat, lipid, glikogen dan kumpulan kimia yang ditentukan (aldehid, tirosin, dll.).

Maklumat yang diberikan oleh teknik ini dapat memberikan panduan bukan hanya untuk mengenal pasti sel, tetapi juga untuk diagnosis pelbagai patologi.

Sebagai contoh, noda sitokimia sangat berguna dalam membezakan antara pelbagai jenis leukemia, kerana sebilangan sel mengekspresikan enzim tertentu atau bahan utama dan yang lain tidak.

Sebaliknya, perlu diperhatikan bahawa untuk penggunaan sitokimia mungkin, pertimbangan berikut mesti diambil:

1) Bahan mesti dilumpuhkan di tempat ia dijumpai secara semula jadi.

2) Bahan mesti dikenal pasti menggunakan substrat yang bertindak balas secara khusus dengannya dan bukan dengan sebatian lain.

Utiliti

Sampel yang dapat dikaji melalui teknik sitokimia adalah:

- Darah periferi yang berlanjutan.

- Sumsum tulang yang dipanjangkan.

- Tisu yang diperbaiki untuk teknik histokimia.

- Sel yang diperbaiki oleh sitocentrifugation.

Teknik sitokimia sangat menyokong dalam bidang hematologi, kerana banyak digunakan untuk membantu diagnosis dan pembezaan jenis leukemia tertentu.

Contohnya: Reaksi esterase digunakan untuk membezakan leukemia myelomonocytic dari leukemia monositik akut.

Darah sumsum tulang dan darah periferal dari pesakit ini serupa, kerana beberapa sel sukar dikenal pasti secara morfologi sahaja. Untuk ini, ujian esterase dijalankan.

Pada yang pertama, esterase spesifik positif, sementara yang kedua, esterase tidak spesifik positif.

Mereka juga sangat berguna dalam histologi, kerana, misalnya, penggunaan teknik pewarnaan logam berat (impregnasi perak) mengotorkan serat retikular warna coklat yang kuat pada tisu miokardium.

Teknik dalam sitokimia

Teknik yang paling banyak digunakan akan dijelaskan di bawah:

- Penggunaan pewarna

Noda yang digunakan sangat berbeza dalam teknik sitokimia dan ini boleh dikelaskan mengikut beberapa sudut pandangan:

Menurut radikal yang mereka mempunyai pertalian

Mereka dibahagikan kepada: berasid, asas atau neutral. Mereka adalah yang paling mudah dan paling banyak digunakan sepanjang sejarah, yang membolehkan kita membezakan komponen basofilik dari yang asidofilik. Contoh: pewarnaan hematoxylin-eosin.

Dalam kes ini, inti sel berwarna biru (mereka mengambil hematoxylin, yang merupakan noda asas) dan sitoplasma, berwarna merah (mereka mengambil eosin, yang merupakan noda asid).

Mengikut warna yang mereka sediakan

Mereka boleh menjadi ortokromatik atau metakromatik. Orthochromatics adalah struktur yang mengotorkan struktur warna yang sama dengan pewarna. Contohnya, kes eosin, yang warnanya merah dan berwarna merah.

Sebaliknya, noda metakromatik mempunyai warna yang berbeza dari warna mereka, seperti, misalnya, toluidin, yang warnanya biru dan masih berwarna ungu.

Pewarna vital atau supravital

Mereka adalah pewarna yang tidak berbahaya, iaitu, mereka mewarnai sel dan mereka tetap hidup. Noda-noda ini disebut vital (contohnya trypan blue to stain macrophages) atau supravital (misalnya Janus hijau untuk mengotorkan mitokondria atau merah neutral untuk mengotorkan lisosom).

- Pengesanan lipid dengan menggunakan pewarna larut lemak

Osmium tetroxida

Ia mengotorkan lipid (asid lemak tak jenuh) hitam. Tindak balas ini dapat dilihat dengan mikroskop cahaya, tetapi kerana pewarna ini mempunyai ketumpatan tinggi, ia juga dapat dilihat dengan mikroskop elektron.

Sudan III

Ia adalah salah satu yang paling kerap digunakan. Pewarna ini meresap dan larut dalam tisu, terkumpul di dalam titisan lipid. Warnanya merah merah.

Noda hitam Sudan B

Ia menghasilkan kontras yang lebih baik daripada yang sebelumnya kerana dapat larut juga dalam fosfolipid dan kolesterol. Ia berguna untuk mengesan butiran azurofilik dan granulosit matang dan pendahulunya. Oleh itu ia mengenal pasti leukemia myeloid.

- Pewarnaan kumpulan aldehid (noda Schiff asid berkala)

Noda Schiff asid berkala dapat mengesan tiga jenis kumpulan aldehid. Mereka adalah:

- aldehid bebas, terdapat secara semula jadi dalam tisu (reaksi plasma).

- Aldehid dihasilkan oleh pengoksidaan selektif (tindak balas PAS).

- Aldehid dihasilkan oleh hidrolisis selektif (tindak balas Feulgen).

Reaksi PAS

Pewarnaan ini berdasarkan pengesanan jenis karbohidrat tertentu, seperti glikogen. Asid berkala Schiff memutuskan ikatan CC karbohidrat kerana pengoksidaan kumpulan glikolik 1-2, berjaya membebaskan kumpulan aldehid.

Kumpulan aldehid bebas bertindak balas dengan reagen Schiff dan membentuk sebatian ungu-merah. Penampilan warna ungu-merah menunjukkan reaksi positif.

Ujian ini positif pada sel tumbuhan, mengesan kanji, selulosa, hemiselulosa dan peptin. Semasa di sel haiwan ia mengesan mukin, mukoprotein, asid hyaluronik dan kitin.

Di samping itu, ia berguna dalam diagnosis leukemia limfoblastik atau eritroleukemia, antara patologi lain dari jenis myelodysplastic.

Sekiranya karbohidrat berasid, noda biru alcian boleh digunakan. Ujiannya positif jika diperhatikan warna biru muda / pirus.

Tindak balas plasmal

Reaksi plasma menunjukkan kehadiran aldehid alifatik rantai panjang tertentu seperti sawit dan stearal. Teknik ini diterapkan pada bahagian histologi beku. Ia dirawat secara langsung dengan reagen Schiff.

Tindak balas Feulgen

Teknik ini mengesan kehadiran DNA. Teknik ini terdiri daripada meletakkan tisu tetap ke hidrolisis asid lemah untuk kemudian membuatnya bereaksi dengan reagen Schiff.

Hidrolisis mendedahkan kumpulan deoksiribosa aldehid pada hubungan deoksiribosa-purin. Reagen Schiff kemudian bertindak balas dengan kumpulan aldehid yang dibiarkan bebas.

Tindak balas ini positif pada inti dan negatif pada sitoplasma sel. Positif dibuktikan dengan adanya warna merah.

Sekiranya teknik ini digabungkan dengan metil hijau-pironin, adalah mungkin untuk mengesan DNA dan RNA secara serentak.

- Noda sitokimia untuk struktur protein

Untuk ini, reaksi Millon boleh digunakan, yang menggunakan merkuri nitrat sebagai reagen. Struktur yang mengandungi asid amino aromatik akan berwarna merah.

- Noda sitokimia yang menggunakan substrat untuk menunjukkan kehadiran enzim

Noda ini berdasarkan pengeraman sampel biologi dengan substrat tertentu dan produk tindak balas kemudiannya bertindak balas dengan garam diazo untuk membentuk kompleks berwarna.

Esterase

Enzim ini terdapat di lisosom beberapa sel darah dan mampu menghidrolisis ester organik yang melepaskan naftol. Yang terakhir membentuk pewarna azo yang tidak larut ketika mengikat garam diazo, mengotorkan tempat di mana reaksi berlaku.

Terdapat beberapa substrat dan bergantung pada mana yang digunakan, esterase spesifik dan esterase tidak spesifik dapat dikenal pasti. Yang pertama terdapat dalam sel yang belum matang dari siri myeloid dan yang kedua dalam sel yang berasal dari monosit.

Substrat yang digunakan untuk penentuan esterase tertentu adalah: naphthol-AS-D chloroacetate. Sementara untuk penentuan esterase tidak spesifik beberapa substrat boleh digunakan seperti naftol AS-D asetat, alpha naphthyl asetat dan alpha naphthyl butyrate.

Dalam kedua kes tersebut sel akan berwarna merah pekat ketika reaksi positif.

Myeloperoxidase

Enzim ini terdapat dalam butiran azurofilik sel granulosit dan monosit.

Pengesanannya digunakan untuk membezakan leukemia asal myeloid daripada limfoid. Sel yang mengandungi myeloperoxidases bertukar kuning kuning.

Fosfatase

Enzim ini mengeluarkan asid fosforik dari substrat yang berbeza. Mereka berbeza antara satu sama lain mengikut kekhususan substrat, pH dan tindakan perencat dan inaktivator.

Antara yang terkenal ialah fosfomonoesterase yang menghidrolisis ester sederhana (PO). Contoh: fosfatase alkali dan fosfatase asid, serta fosfididase yang menghidrolisis ikatan (PN). Ini digunakan untuk membezakan sindrom limfoproliferatif dan untuk diagnosis leukemia sel berbulu.

- Pewarnaan trikromik

Trichrome Mallary-Azan

Mereka berguna untuk membezakan sitoplasma sel dari serat tisu penghubung. Sel berwarna merah dan serat kolagen berwarna biru.

Trichrome Masson

Ini mempunyai utiliti yang sama dengan yang sebelumnya tetapi, dalam kes ini, sel berwarna merah dan serat kolagen berwarna hijau.

- Pewarna yang mengotorkan organel tertentu

Janus Hijau

Secara selektif mengotorkan mitokondria.

Garam perak dan asid osmik

Mengotorkan radas Golgi.

Toluidin biru

Mengotorkan badan Nissi

Garam perak dan PAS

Mereka mengotorkan serat retikular dan lamina basal.

Resorcin Orcein dan fuchsin

Mereka mengecat gentian elastik. Dengan yang pertama mereka dicelup coklat dan dengan warna biru tua atau ungu kedua.

- Teknik lain yang digunakan dalam sitokimia

Penggunaan bahan pendarfluor atau fluorokrom

Terdapat teknik yang menggunakan bahan pendarfluor untuk mengkaji lokasi struktur dalam sel. Tindak balas ini dilihat dengan mikroskop khas yang disebut pendarfluor. Contoh: Teknik IFI (Imunofluorescence Tidak Langsung).

Pengesanan komponen sel dengan imunokitokimia

Teknik ini sangat berguna dalam perubatan kerana ia membantu mengesan struktur sel tertentu dan juga mengukurnya. Reaksi ini berdasarkan reaksi antigen-antibodi. Contohnya: teknik ELISA (Enzyme Immuno Assay).

cadangan

- Perlu menggunakan smear kawalan untuk menilai prestasi pewarna yang baik.

- Smear segar harus digunakan untuk menjalani pewarnaan sitokimia. Sekiranya tidak mungkin, mereka harus dilindungi dari cahaya dan disimpan pada suhu 4 ° C.

- Perlu diberi perhatian agar fiksatif yang digunakan tidak mempengaruhi bahan yang hendak disiasat secara negatif. Dengan kata lain, ia mesti dihalang daripada mengekstrak atau menghalangnya.

- Masa penggunaan fiksatif mesti dihormati, kerana pada umumnya hanya perlu beberapa saat, kerana memaparkan smear untuk waktu yang lebih lama pada fiksatif dapat merosakkan beberapa enzim.

Rujukan

1. "Sitokimia." Wikipedia, Ensiklopedia Percuma. 30 Jun 2018, 17:34 UTC. 9 Jul 2019, 02:53 Terdapat di: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metode Metregnation Impregnation for the Study of Myocardial Reticular Fibers: Kajian Perbandingan. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Terdapat di: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochemistry of acid phosphatase: pertimbangan metodologi. Rev Diagn Biol 200; 50 (2): 89-92. Terdapat di: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologi selular dan molekul. Edisi ke-11. Pengarang Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Alat klasik untuk mempelajari biologi sel. TP 1 (bahan tambahan) - Biologi Sel. Terdapat di: dbbe.fcen.uba.ar