DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): CIRI, RASIONAL, PENGGUNAAN - KIMIA - 2026

The DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) adalah pewarna oleh hartanah pendarfluor berfungsi sebagai satu penanda, digunakan secara meluas dalam seni pendarfluor mikroskop atau aliran sitometri, antara lain. Fluoresensi yang dipancarkannya berwarna biru terang, pengujaannya berlaku antara 455-461 nm (sinar UV).

Pewarna DAPI dapat melalui membran sel sel mati dengan mudah. Ia juga dapat mengotorkan inti sel hidup, tetapi dalam kes ini, kepekatannya mestilah lebih tinggi.

Struktur kimia pewarna pendarfluor DAPI. Sumber: Gambar: Fail: DAPI.svg adalah versi vektor fail ini. Ia harus digunakan sebagai pengganti gambar raster ini apabila tidak kalah / Richard Wheeler (Zephyris) Gambar diedit

Pewarna tersebut dapat mengakses DNA selular yang mempunyai pertalian khusus, mengikat dengan kuat pada asas nitrogen adenin dan timin. Atas sebab ini sangat berguna dalam beberapa teknik biologi molekul.

Sebatian ini tergolong dalam kumpulan pewarna indole dan telah terbukti mempunyai kepekaan yang lebih besar terhadap DNA daripada etidium bromida dan propidium iodida, terutama pada gel agarosa.

Penggunaan pewarna pendarfluor ini sangat luas, kerana berguna untuk: mengkaji perubahan DNA dalam proses apoptosis (kematian sel) dan oleh itu mengesan sel dalam proses ini; untuk gambar jejak DNA (percetakan foto DNA); untuk mengkaji pencemaran bakteria; atau untuk menggambarkan pemisahan nuklear.

Ini juga telah digunakan dalam kajian pita kromosom, dalam pengesanan DNA Mycoplasmas sp, interaksi DNA-protein, pewarnaan dan penghitungan sel dengan imunofluoresensi dan bahkan untuk mewarnai biji-bijian debunga matang.

ciri

DAPI adalah singkatan dari nama kimianya (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). Formula molekulnya ialah C ₁₆ H ₁₅ N _5. Ia mempunyai berat molekul 350.3. Berhampiran julat cahaya UV (345 hingga 358 nm) pengujaan maksimum kompleks DAPI-DNA berlaku, sementara pelepasan pendarfluor maksimum berlaku antara 455-461 nm.

Pewarna ini dicirikan sebagai serbuk kuning, tetapi struktur yang ditandai dengan fluorofor ini memancarkan cahaya biru yang cemerlang.

Ini adalah sebatian yang larut dalam air, namun, untuk mempercepat pembubarannya, haba dapat digunakan. Ia boleh dicairkan dengan PBS tetapi tidak dilarutkan secara langsung di dalamnya.

Setelah pewarna disiapkan, ia mesti disimpan dalam gelap, iaitu terlindung dari cahaya, pada suhu 2 hingga 8 ° C (peti sejuk). Dalam keadaan ini, pewarna stabil selama lebih dari 3 minggu atau bulan.

Sekiranya dilindungi dari cahaya tetapi dibiarkan pada suhu bilik kestabilannya menurun hingga 2 atau 3 minggu, tetapi terdedah kepada cahaya langsung, kemerosotannya sangat cepat. Sekiranya anda ingin menyimpan lebih lama, ia boleh didinginkan pada suhu -20 ° C yang diedarkan dalam aliquots.

Asas

Pewarnaan ini berdasarkan penghasilan nuklear dalam teknik biologi molekul utama, seperti: sitometri aliran, mikroskopi pendarfluor dan pewarnaan kromosom metafasa atau inti interphase, antara lain.

Teknik ini berdasarkan pertalian besar pewarna untuk asas nitrogen (adenin dan timin) yang terkandung dalam bahan genetik (DNA) di alur kecil. Walaupun pada tahap sitoplasma, ia meninggalkan latar belakang yang sangat sedikit.

Apabila pewarna pendarfluor mengikat ke kawasan adenin dan timin DNA, pendarfluor meningkat dengan ketara (20 kali lebih banyak). Warna yang dipancarkannya berwarna biru terang. Terutama, tidak ada pelepasan pendarfluor ketika mengikat pasangan asas GC (guanine-sitosin).

Penting untuk diperhatikan bahawa walaupun ia juga mempunyai hubungan dengan RNA, ini tidak menimbulkan masalah, kerana tahap pelepasan tenaga tertinggi dari molekul ini berlaku pada panjang gelombang lain (500 nm), tidak seperti DNA, yang melakukannya pada 460 nm. Tambahan pula, peningkatan pendarfluor setelah terikat pada RNA hanya 20%.

DAPI digunakan lebih banyak untuk mengotorkan sel mati (tetap) daripada sel hidup, kerana kepekatan pewarna yang jauh lebih tinggi diperlukan untuk mengotorkan yang terakhir, ini kerana membran sel lebih kurang telap terhadap DAPI ketika masih hidup.

Pewarna DAPI boleh digunakan dalam kombinasi dengan fluorofor merah dan hijau untuk pengalaman pelbagai warna.

Gunakan

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) adalah fluorofor yang sangat baik dan oleh itu digunakan secara meluas dalam pelbagai teknik dan untuk pelbagai tujuan. Berikut menerangkan penggunaan DAPI dalam teknik utama.

Sitometri aliran

Penyelidik Gohde, Schumann dan Zante pada tahun 1978 adalah yang pertama menggunakan dan mengusulkan DAPI sebagai fluorophore dalam teknik sitometri aliran, yang berjaya kerana kepekaannya yang tinggi terhadap DNA dan intensiti tinggi dalam pelepasan pendarfluor.

Penggunaan DAPI dalam teknik ini memungkinkan kajian kitaran sel, pengukuran sel dan pewarnaan sel hidup dan mati.

Walaupun terdapat pewarna lain, seperti ethidium bromide, Hoechst oxide, acridine orange dan propidium iodide, DAPI adalah salah satu yang paling banyak digunakan kerana lebih fotostat daripada yang disebutkan sebelumnya.

Untuk teknik ini diperlukan untuk memperbaiki sel, untuk ini, etanol mutlak atau paraformaldehid 4% dapat digunakan. Sampel disentrifugasi dan supernatan dibuang, kemudian sel dihidrat dengan menambahkan 5 ml PBS buffer selama 15 minit.

Sementara masa yang berlalu siapkan pewarnaan DAPI dengan penyangga pewarnaan (FOXP3 dari BioLegend) pada kepekatan 3 µM.

Sentrifus sampel, buangkan supernatan, dan kemudian tutup dengan 1 ml larutan DAPI selama 15 minit pada suhu bilik.

Bawa sampel ke sitometer aliran dengan laser yang sesuai.

Aliran Mikrofluorometri

Teknik lain yang digunakan DAPI adalah dalam aliran mikro-fluorometri bersama dengan fluorofor lain yang disebut mithramycin. Kedua-duanya berguna untuk mengukur DNA kloroplas secara individu, tetapi DAPI sangat sesuai untuk mengukur zarah bakteriofag T4.

Hibridisasi

Teknik ini pada dasarnya menggunakan probe DNA yang dilabelkan dengan pewarna pendarfluor yang boleh menjadi DAPI.

Sampel memerlukan rawatan haba untuk mendewarnakan DNA untai dua dan menukarnya menjadi dua helai tunggal. Ia kemudiannya dihibridisasi dengan probe DNA denaturated berlabel DAPI yang mempunyai urutan minat.

Kemudian ia dicuci untuk menghilangkan apa yang tidak dihibridisasi, kontras digunakan untuk menggambarkan DNA. Mikroskop pendarfluor memungkinkan pemerhatian probe hibridisasi.

Teknik ini mempunyai tujuan untuk mengesan urutan tertentu dalam DNA kromosom, dapat membuat diagnosis penyakit tertentu.

Teknik molekul sitot ini sangat membantu dalam menentukan perincian dalam kajian kariotip. Sebagai contoh, dia telah menunjukkan kawasan adenosin dan timin yang kaya dengan pasangan asas yang disebut kawasan heterokromatik atau jalur DAPI.

Teknik ini digunakan secara meluas untuk kajian kromosom dan kromatin pada tumbuhan dan haiwan, serta dalam diagnosis patologi pranatal dan hematologi pada manusia.

Dalam teknik ini, kepekatan DAPI yang disarankan adalah 150 ng / ml selama 15 minit.

Slaid yang dipasang hendaklah disimpan terlindung dari cahaya pada suhu 2-8 ° C.

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel dibetulkan dengan paraformaldehid 4%. Sekiranya noda lain akan digunakan, DAPI ditinggalkan sebagai penghitung dan sel ditutup dengan larutan PBS selama 15 minit. Sementara masa berlalu, sediakan penyelesaian DAPI dengan mencairkan dengan PBS, sehingga kepekatan akhir adalah 300 µM.

Kemudian lebihan PBS dikeluarkan dan ditutup dengan DAPI selama 5 minit. Mencuci beberapa kali. Slaid dilihat di bawah mikroskop pendarfluor di bawah penapis yang sesuai.

Helaian keselamatan

Sebatian ini mesti ditangani dengan berhati-hati, kerana ia adalah sebatian yang mempunyai sifat mutagenik. Karbon aktif digunakan untuk menghilangkan sebatian ini dari larutan berair yang akan dibuang.

Sarung tangan, gaun dan cermin mata keselamatan mesti digunakan untuk mengelakkan kemalangan dengan reagen ini. Sekiranya bersentuhan dengan kulit atau mukosa, kawasan tersebut harus dibasuh dengan air yang mencukupi.

Anda tidak boleh melakukan pipet reagen ini melalui mulut, menggunakan pipet.

Jangan mencemarkan reagen dengan agen mikroba kerana ini akan menyebabkan keputusan yang salah.

Jangan mencairkan noda DAPI lebih daripada yang disyorkan, kerana ia akan mengurangkan kualiti noda dengan ketara.

Jangan dedahkan reagen ke cahaya langsung, atau tetap panas kerana ini mengurangkan pendarfluor.

Rujukan

1. Brammer S, Toniazzo C dan Poersch L. Corantes biasanya terlibat dalam sitogenetik tumbuhan. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Terdapat dari: scielo.
2. Makmal Impath. DAPI. Terdapat di: menarinidiagnostics.com/
3. Makmal Cytocell. 2019. Arahan penggunaan DAPI. boleh didapati di cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Konsep dan teknik dalam ekologi sungai. (2009). Rubrik Pengarang, Sepanyol. Terdapat di: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Penggunaan pendarfluor dalam kaedah pembedah yang diubah untuk menganggarkan bilangan mosit dalam tisu jantung. Arch. Bras. Kardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Boleh didapati dari: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Kehadiran fitoplasma dalam pepaya (Carica papaya) di Mexico. Majalah Chapingo. Siri Hortikultur, 2011; 17 (1), 47-50. Terdapat di: scielo.org.