PROTEINASE K: CIRI, AKTIVITI ENZIMATIK, APLIKASI - BIOLOGI - 2025

The K proteinase merupakan enzim yang dipunyai oleh kumpulan protease serine, iaitu, ia mempunyai dalam tengahnya catalytically aktif asid amino serine dan mempunyai fungsi memecahkan ikatan peptida oleh hidrolisis. Sebaliknya, enzim ini tergolong dalam keluarga protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K mempunyai berat molekul (MW) 28.900 dalton dan diasingkan untuk pertama kalinya pada tahun 1974 dalam ekstrak album Engyodontium jamur, yang sebelumnya dikenal sebagai album Tritirachium Limber.

Struktur molekul Proteinase K. Sumber: Lykchiniadis

Ini memiliki kapasiti proteolitik yang tinggi, ditunjukkan dengan dapat menurunkan keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggeris dieja "keratin", oleh itu ia disebut "proteinase K".

Kerana kekuatannya yang tinggi untuk membelah protein asli, enzim ini berguna dalam pelbagai teknik biologi molekul. Ia digunakan terutamanya untuk mengasingkan dan menyediakan asid nukleik dengan berat molekul tinggi (MW).

Proteinase K berfungsi dengan melepaskan DNA nuklear, sambil menghancurkan protein dan mematikan RNases dan DNases, iaitu, ia menghilangkan nuklease dalam persiapan DNA dan RNA.

Sebaliknya, telah dilihat bahawa proteinase K dapat menghidrolisis beberapa protein asli yang didenaturasi, yang telah menimbulkan minat para penyelidik untuk penggunaannya dalam kajian protein prion (PrPC).

Walau bagaimanapun, walaupun mempunyai potensi proteolitik yang tinggi, terdapat protein yang tahan terhadap tindakan proteinase K. Antaranya adalah beberapa protein tidak normal yang disebut prion (PrPSc), yang berkaitan dengan ensefalopati spongiform yang dapat ditularkan.

Ciri-ciri protein Proteinase K

Proteinase K mempunyai struktur tersier yang terdiri dari tiga lapisan, dengan kepingan β rantai tujuh yang disisipkan di antara dua lapisan heliks. Oleh kerana ia tergolong dalam keluarga peptidase S8, ia dicirikan oleh adanya triad katalitik di laman aktifnya, yang urutannya berurutan (Asp, His dan Ser), yang membezakannya dari keluarga peptidase lain.

Enzim ini dari kumpulan protease serin dicirikan dengan menghidrolisis ikatan peptida yang berdekatan dengan kumpulan karboksilik asid amino alifatik dan aromatik.

Sebaliknya, ia mampu bertindak di hadapan bahan-bahan menghakis tertentu, seperti sodium dodecyl sulfate (SDS), Tris-HCL dan EDTA, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur asalnya.

Ini adalah langkah awal dalam penyediaan protein untuk teknik elektroforesis. Julat pH di mana proteinase K bertindak cukup luas (2.0 hingga 12.0), dengan pH optimum antara 7.5 hingga 12.0, dan titik isoelektriknya adalah 8.9. Seperti yang dapat dilihat, ia aktif terhadap julat pH yang sangat luas.

Ciri lain yang menonjol dalam proteinase K adalah kestabilannya dengan adanya suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktiviti enzimatik

Proteinase K memerlukan kehadiran ion kalsium, walaupun ini tidak mempengaruhi aktivitinya, jika penting untuk mengekalkan kestabilannya.

Agar proteinase K mencerna substrat sepenuhnya, diperlukan waktu hubungan kira-kira 5 minit hingga 2 jam.

Walau bagaimanapun, dalam pengertian ini, Daza et al. Membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada pelbagai masa pendedahan terhadap proteinase K, dan menyimpulkan bahawa inkubasi yang berpanjangan (hingga 24 jam) meningkatkan kualiti DNA dengan ketara.

Namun, berkaitan dengan kepekatan enzim proteinase K yang digunakan dalam protokol yang berlainan, dapat dikatakan bahawa ia sangat bervariasi.

Ia dapat digunakan dari kepekatan yang sangat rendah (5 µg / ml) hingga kepekatan 500 µg / ml. Tetapi kepekatan kerja yang paling biasa berkisar antara 50-100μg / ml, terutama untuk pencernaan protein dan inaktivasi nuclease. Walaupun untuk rawatan tisu diperlukan kepekatan 2 mg / ml.

Permohonan

Aplikasinya sangat luas dan dapat diringkaskan sebagai berikut:

-Ia digunakan dalam pencernaan protein dan pengekstrakan DNA dengan pelbagai kaedah seperti: salting-out, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), kalium asetat yang diubah suai dan pengekstrakan dengan sodium iodide.

-Inaktivasi nuklease (RNases dan DNases).

-Dalam teknik hibridisasi in situ (HIS), untuk membantu pembebasan asid nukleik, selain menghilangkan protein yang tidak diingini.

-Pengubahsuaian protein.

-Di peringkat penyelidikan, dalam pelbagai kajian.

Kelebihan proteinase K

Beberapa kajian perbandingan telah dilakukan antara teknik pengekstrakan DNA yang menggunakan Proteinase K, dengan yang lain yang tidak menggunakannya dan semuanya menyimpulkan bahawa terdapat manfaat yang lebih besar ketika menggunakan enzim. Kelebihan termasuk yang berikut:

-DNA berat molekul tinggi, berkualiti tinggi dan kesucian diperoleh.

-DNA yang diekstrak stabil sehingga 3 bulan.

DNA yang diekstrak dapat digunakan dalam teknik berikut: Blot selatan, reaksi berantai polimerase (PCR), elektroforesis, antara lain.

Proteinase K tahan protein

Pelbagai penyelidikan telah menyimpulkan bahawa prion (protein PrPSc toksik tidak normal) berbeza dengan protein PrPC (asli) dengan tahan terhadap tindakan proteinase K, sementara PrPC sensitif terhadap tindakannya.

Penulis lain telah menjelaskan bahawa dalam struktur PrPSc terdapat bahagian sensitif dan yang lain tahan terhadap proteinase K. Walau bagaimanapun, kedua-dua bahagiannya sama toksik dan berjangkit.

Sebaliknya, Bastian et al. Pada tahun 1987 mengasingkan 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kda dari spesies Spiroplasma mirum. Semua didapati tahan terhadap tindakan proteinase K dan juga mempunyai tindak balas silang dengan beberapa prion.

Telah diketahui bahawa spesies ini boleh menyebabkan katarak dan kerosakan neurologi yang penting dan disebabkan oleh penemuan saintifik Bastian, antara penyelidikan lain, usaha telah dilakukan untuk menghubungkan mikroorganisma ini dengan ensefalopati spongiform yang dapat ditularkan.

Walau bagaimanapun, etiologi patologi neurologi degeneratif ini terus dikaitkan dengan prion hari ini.

Dalam pengertian ini, Butler et al. Pada tahun 1991 mengenal pasti dan mencirikan kelas protein yang tahan terhadap proteinase K 40 kda dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini menyerang babi, menjangkiti tisu mereka, tetapi dalam kes ini tidak ada tindak balas silang dengan prion yang diuji.

Lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menyelesaikan banyak perkara yang tidak diketahui dalam hal ini.

Rujukan

1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum kepada protein fibril yang berkaitan dengan scrapie bertindak balas secara silang dengan protein Spiroplasma miru m fibril. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Penilaian kaedah pengekstrakan dan pemurnian DNA dari tisu otot tetap formaldehid kader yang tidak dikenali. Majalah Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, And Mcgarrity G. Pengenalpastian dan Karakterisasi Proteinase K-Resistant Protein pada Anggota Kelas Mollicutes. Jangkitan dan Kekebalan, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Perbandingan dua protokol pengekstrakan DNA Trypanosoma cruzi yang ditanam dalam medium axenic. Pendeta Peru. Med. Kesihatan Awam 2014; 31 (2): 222-227. Terdapat di: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan keberkesanan lima protokol pengekstrakan DNA dari bahan parafinisasi untuk kajian molekul. Pendeta Univ Kosta Rika. 2007; 1 (1): 10-19.