PENJUJUKAN DNA: MAXAM-GILBERT, KAEDAH DAN CONTOH - BIOLOGI - 2026

The penjujukan DNA (asid deoksiribonukleik) adalah satu prosedur di makmal biologi molekul yang membolehkan untuk mengetahui perintah nukleotida dalam bahan genetik kepentingan. Selanjutnya, penjujukan RNA (asid ribonukleat) juga dapat dinyatakan.

Teknik ini sangat diperlukan untuk pengembangan sains biologi. Ini juga berlaku untuk bidang pengetahuan lain - seperti diagnosis perubatan dan penyelidikan forensik, misalnya.

Sumber: pixabay.com

Sebelumnya, penjujukan untaian DNA dianggap sebagai aktiviti yang perlahan dan mahal, yang memungkinkan pengenalan hanya beberapa pasangan asas dalam oligonukleotida.

Hari ini, dengan semua kemajuan dalam sains, penjujukan DNA adalah operasi rutin di banyak makmal di seluruh dunia berkat sumbangan penyelidikan selama hampir 50 tahun dalam bidang ini. Dari segi panjang rantai, hingga berjuta-juta pasangan asas dapat disusun dalam masa yang sangat singkat.

Untuk melakukan ini, terdapat puluhan teknik yang dikembangkan dengan harga dan ketepatan yang berbeza-beza. Dalam artikel ini, kami akan menerangkan teknik klasik dan moden, masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangannya.

Sehingga kini, teknik penjujukan membolehkan memperoleh urutan genom lengkap, dari prokariota kecil dan ragi hingga genom manusia.

Struktur DNA

Untuk memahami kaedah dan teknik yang digunakan untuk penjujukan DNA, perlu mengetahui aspek utama tertentu dari struktur dan komposisi molekul.

DNA adalah biomolekul yang terdapat di semua makhluk hidup, dari bakteria hingga haiwan akuatik yang besar. Organel - seperti mitokondria dan kloroplas - mempunyai molekul DNA bulat di dalamnya. Walaupun dalam beberapa virus, bahan genetik yang dijumpai adalah DNA.

Secara struktural, DNA adalah kumpulan nukleotida. Masing-masing terdiri daripada karbohidrat, asas nitrogen (A, T, C atau G) dan kumpulan fosfat. Tujuan penjujukan DNA adalah untuk mengungkapkan urutan di mana empat asas nitrogen terdapat dalam urutan.

Sejarah

Pada pertengahan tahun 1950-an, penyelidik Watson dan Crick menerangkan struktur DNA menggunakan teknik kristolografi. Walau bagaimanapun, tidak ada penyelidik yang dapat mencari jalan untuk menguraikan urutannya.

Walaupun ada pendahulu tertentu, peristiwa yang paling penting adalah penciptaan kaedah Sanger, pada tahun 1977. Frederick Sanger, bapa kaedah itu, adalah seorang ahli biokimia Inggeris, pemenang dua hadiah Nobel kerana sumbangannya yang besar terhadap ilmu biologi.

Teknik ini juga dikenali dalam literatur sebagai "penghentian rantai" atau dideoxynucleotides. Prinsip teknik ini dan prinsip yang dikembangkan berdasarkan peningkatan dan inovasi akan dijelaskan di bawah.

Kaedah Sanger

Perkembangan kaedah Sanger mewakili peristiwa penting dalam biologi molekul. Ia melibatkan komponen asas proses replikasi DNA yang biasanya berlaku di dalam sel, tetapi menambahkan komponen khas: dideoxynucleotides.

Komponen utama tindak balas

- DNA polimerase: enzim polimerase DNA adalah elemen penting dalam proses ini. Molekul ini mengambil bahagian dalam replikasi untaian DNA dan peranannya adalah sintesis helai baru, memasangkan trifosfat deoksiribonukleotida dengan pelengkap.

Ingatlah bahawa dalam DNA, timmin (T) berpasangan dengan adenin (A) melalui dua ikatan hidrogen, sementara sitosin (C) melakukannya dengan guanin (G) melalui tiga ikatan.

- Nukleotida: Penjujukan penjujukan melibatkan dua jenis nukleotida, empat 2'-deoxynucleotides (disingkat dATP, dGTP, dCTP dan dTTP) dan empat dideoxynucleotides khas (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP).

Walaupun dideoxynucleotides serupa dengan monomer yang biasanya dimasukkan ke dalam DNA, mereka tidak mempunyai kumpulan -OH dalam strukturnya. Ini menjadikan mustahil untuk menambahkan nukleotida baru ke rantai.

Oleh itu, apabila nukleotida khas ditambahkan - dengan cara yang sama sekali rawak - ke rantai dalam pembentukan, sintesisnya lumpuh. Oleh itu, pada akhir reaksi, terdapat rantai dengan ukuran yang berbeza, masing-masing di mana reaksi dihentikan pada titik yang berbeza.

Secara eksperimen, empat ujian disediakan. Masing-masing mengandungi DNA yang diekstrak dari sampel biologi yang menarik, nukleotida normal, dan salah satu daripada empat jenis nukleotida khas. Atau nukleotida khas ditandai dengan beberapa jenis penanda pendarfluor (lihat penjujukan automatik di bawah).

Membaca hasilnya

Langkah pertama adalah memisahkan setiap rantai yang disintesis mengikut ukurannya. Sebilangannya akan lebih lama daripada yang lain, bergantung pada tempat pangkalan khas digabungkan.

Terdapat teknik biokimia yang berbeza yang memungkinkan pemisahan komponen campuran menggunakan ukuran sebagai sifat diskriminasi. Dalam kaedah Sanger, rantai yang berbeza dipisahkan oleh elektroforesis. Dalam varian teknik yang lebih canggih, elektroforesis kapilari digunakan.

Oleh itu, helai yang lebih panjang bergerak kurang daripada varian yang lebih pendek. Sistem ini kemudian melalui pembaca yang mengenali penanda yang disertakan dalam setiap dideoxynucleotide. Dengan cara ini, susunan urutan dapat diketahui.

Teknik "generasi pertama" ini mampu membaca serpihan DNA tidak lebih besar dari 1 kilobase. Pada masa ini, kaedah Sanger digunakan di pelbagai makmal, umumnya dalam varian modennya. Di samping itu, ia digunakan untuk mengesahkan hasil yang diperoleh dengan teknik yang paling kompleks - tetapi kurang tepat.

Penjujukan automatik

Apabila penjujukan diperlukan dalam skala besar, prosesnya dipercepat melalui automasi. Ini adalah variasi kaedah penamatan rantai Sanger, di mana primer dilabel dengan produk pendarfluor untuk membezakannya.

Selepas itu, produk tindak balas dijalankan dalam elektroforesis - semuanya pada satu jalur. Oleh kerana setiap serpihan keluar dari bahagian akhir gel, ia cepat dikenali oleh label pendarfluornya, dengan ralat sekitar 1%.

Sistem yang paling canggih mempunyai sistem sehingga 96 tiub kapilari yang dikendalikan oleh komputer yang digabungkan dengan robot. Maksudnya, 96 sampel DNA dapat diuji secara serentak. Oleh itu, proses yang melibatkan elektroforesis dan analisis hasilnya sepenuhnya automatik.

Dalam satu hari, sistem ini dapat menyusun hingga 550,000 pangkalan. Semasa prosesnya, tenaga kerja manusia tidak diperlukan, hanya memerlukan sekitar 15 minit untuk memulakan kaedah tersebut.

Jujukan Maxam-Gilbert

Pada masa yang sama Sanger menerbitkan karyanya, dua penyelidik bernama Allan Maxan dan Walter Gilbert berjaya mengembangkan kaedah lain untuk mendapatkan urutan DNA. Kaedah ini mendapat populariti pada masa itu, tetapi kemudian digantikan oleh peningkatan kaedah Sanger.

Berbeza dengan kaedah Sanger, penjujukan Maxan dan Gilbert (atau penjujukan kimia, seperti juga diketahui) tidak melibatkan reaksi hibridisasi. Metodologi terdiri daripada pelabelan dengan agen reaktif pada satu hujung, diikuti dengan proses pemurnian.

Salah satu aspek negatif dari teknik ini terletak pada kerumitannya yang sangat besar dan penggunaan bahan kimia yang berbahaya bagi pengguna. Kerosakan kimia disebabkan oleh penggunaan DMS, asid formik, hidrazin, dan hidrazin dengan garam.

Proses

Protokol dimulakan dengan pelabelan pada hujung 5 'helai dengan penanda fosforus 32, kemudian berlaku pengubahsuaian kimia dari asas nitrogen dan ia dipisahkan. Akhirnya, pembelahan kawasan abasik berlaku.

Mula-mula anda memendekkan rentetan yang ingin anda urutkan menjadi segmen yang lebih kecil. Langkah ini dilakukan dengan enzim sekatan, yang menghasilkan ujung yang menonjol.

Seterusnya, tindak balas dilakukan dengan fosfatase alkali, yang tujuannya adalah untuk menghilangkan kumpulan fosfat. Oleh itu, polinukleotida kinase dapat digunakan untuk melakukan pelabelan.

Rantai itu didenaturasi (kedua helai terbuka). Kemudian bahan kimia tersebut digunakan. Tindak balas pembelahan ini dilakukan secara terkawal dan diketahui jenis ikatan apa yang masing-masing pecahkan bahan kimia.

Membaca hasilnya

Seperti dalam kaedah Sanger, pembacaan hasilnya melibatkan pemisahan mengikut ukuran rantai yang diperoleh dalam sistem elektroforesis. Sistem yang terdiri daripada poliakrilamida memungkinkan penyelesaian yang sangat mencukupi untuk membaca gel.

Penjujukan besar-besaran

Penjujukan besar-besaran merangkumi serangkaian kaedah novel, disingkat NGS, dari bahasa Inggeris "Next Generation Sequencing".

Kaedah yang dikelaskan sebagai NGS memerlukan langkah penguatan DNA sebelumnya (mereka tidak berfungsi dengan satu molekul). Tambahan pula, platform yang digunakan berbeza-beza. Prinsip kaedah yang paling popular akan dijelaskan di bawah:

Pyrosequencing

Ini melibatkan pemantauan pembebasan pirofosfat, yang terjadi setiap kali nukleotida baru ditambahkan ke helai DNA. Sistem enzim digabungkan, sehingga pelepasan cahaya (yang dapat dikesan oleh kamera) berlaku setiap kali nukleotida baru dimasukkan.

Prosesnya dimulakan dengan inkubasi berasingan bagi setiap asas nitrogen untuk mengesahkan sama ada terdapat pelepasan cahaya atau tidak. Pyrosequencing dapat membaca helai panjang, tetapi kadar ralat yang dijumpai tinggi.

Penjujukan sintesis

Ini melibatkan penggabungan nukleotida berlabel. Komponen pendarfluor ini ditambah, dicuci, dan nukleotida yang digabungkan diperhatikan. Kemudian, label nukleotida dikeluarkan, dan sintesis helai dapat diteruskan. Pada langkah seterusnya, nukleotida berlabel juga akan digabungkan, dan langkah-langkah di atas akan diulang.

Kelemahan teknik ini berlaku apabila penanda pendarfluor tidak dikeluarkan sepenuhnya. Pelepasan ini menimbulkan kesalahan latar belakang, mengakibatkan kesalahan yang ketara.

Penjujukan ligasi

Teknik ini berbeza dari yang lain, kerana tidak menggunakan polimerase DNA. Sebaliknya, enzim utama untuk metodologi ini adalah ligase. Di sini, serpihan DNA berlabel fluoresen digunakan, ia dihubungkan oleh enzim dan ia dikesan.

Masalah terbesar dengan teknik ini ialah kepingan pendek yang mampu diproses.

Penjujukan Ion Torrent

Teknik ini berdasarkan pengukuran ion H ⁺ yang dilepaskan setiap kali nukleotida baru dimasukkan. Prinsipnya agak serupa dengan pyrosequencing, tetapi jauh lebih murah.

Contoh

Penjujukan genom manusia

Menguruskan genom manusia telah menjadi salah satu cabaran yang paling menjanjikan dalam biologi, serta menjadi salah satu persaingan yang paling terkenal dalam sejarah sains. Sebenarnya, bagi para saintis yang terlibat dalam projek ini, penjujukan genom menjadi persaingan.

Pada tahun 1990 ia memulai apa yang disebut "projek genom manusia", yang dipimpin oleh saintis terkenal, pemenang Hadiah Nobel, James Watson. Setelah setahun, pada tahun 1991, Venter menyahut cabaran "mengalahkan" Watson dan mengurutkan genom di hadapannya. Namun, pada tahun 1992, Watson telah bersara dan perintah itu diambil oleh penyelidik lain.

Pada tahun 1995 Venter mengumumkan kejayaannya dalam penjujukan lengkap genom bakteria dengan kaedah penjujukan secara rawak. Begitu juga, pasukan lawan mengumumkan setahun kemudian penjujukan genom ragi.

Pada tahun 2000, ijazah ini ditamatkan. Kedua-dua syarikat menerbitkan keseluruhan hasil genom awal mereka dalam dua jurnal sains yang paling berprestij: Alam dan Sains.

Walau bagaimanapun, para saintis terus berusaha memperbaiki cadangan tersebut, dan pada tahun 2006 urutan kromosom manusia tertentu selesai.

Kepentingan dan aplikasi

Mengetahui urutan nukleotida molekul penting seperti DNA sangat berharga bagi ahli biologi dan profesional yang berkaitan. Rangkaian polinukleotida ini mengandungi semua maklumat yang diperlukan untuk pengembangan dan pemeliharaan semua bentuk kehidupan.

Atas sebab-sebab ini, pengetahuan mengenai urutan ini sangat penting untuk penyelidikan biologi. Pada asasnya, penjujukan memungkinkan untuk mengukur salah satu sifat terpenting dari sistem biologi dan untuk mewujudkan perbezaan di antara keduanya.

Pengurutan digunakan secara meluas oleh ahli taksonomi dan ahli sistematik, kerana urutan DNA tertentu memungkinkan menetapkan kriteria untuk menyimpulkan sama ada dua organisma tergolong dalam spesies yang sama atau tidak, selain dapat mengemukakan hipotesis mengenai hubungan filogenetik di antara mereka.

Selain itu, penjujukan DNA mempunyai aplikasi dalam perubatan dan diagnostik. Sebagai contoh, terdapat sistem yang murah dan mudah diakses yang, melalui penjujukan, memungkinkan untuk menilai kecenderungan untuk mengembangkan penyakit tertentu (seperti barah) menggunakan apa yang disebut polimorfisme nukleotida tunggal (SNP).

Penyelidikan jenis jenayah dan forensik juga telah diperkaya dengan teknik penjujukan, yang dapat digunakan sebagai bukti yang dapat dipercayai mengenai penyertaan individu tertentu dalam kejahatan.

Rujukan

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Urutan penjujukan: sejarah penjujukan DNA. Genomik, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Revolusi penjujukan generasi seterusnya dan kesannya terhadap genomik. Sel, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Persaingan saintifik. Dari Galileo ke projek genom manusia. Paraninfo Pengarang.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Penjujukan DNA dengan perencat penghentian rantai. Prosiding akademi sains kebangsaan, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Penjujukan generasi seterusnya mengubah biologi masa kini. Kaedah semula jadi, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Urutan generasi seterusnya. Akhbar Akademik Caister.