PEWARNAAN SPORA: RASIONAL, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2024

The spora pewarnaan adalah kaedah yang digunakan untuk mewarnakan struktur rintangan yang membentuk beberapa genus bakteria apabila dalam keadaan yang tidak sesuai; Struktur ini sesuai dengan bentuk kelangsungan hidup.

Terdapat banyak genera yang membentuk spora; namun, yang utama adalah Bacillus dan Clostridium. Genera ini dianggap lebih relevan kerana mempunyai spesies patogen untuk manusia.

Pewarnaan spora dengan kaedah Shaeffer - Fulton atau Wirtz-Conklin. Dan tambe (pengunggah asal), dari Wikimedia Commons

Setiap bacillus dapat menimbulkan spora. Pada masa pewarnaan penyediaan, spora dapat dijumpai di dalam bacillus (endospore) atau di luarnya (exospore). Dengan teknik pewarnaan konvensional untuk bakteria - seperti noda Gram - spora tetap tidak berwarna.

Pada masa ini, terdapat beberapa metodologi pewarnaan yang mampu menembusi struktur tebal spora untuk mewarnainya. Metodologi ini sangat berbeza; Ini termasuk teknik Dorner, noda Möeller dan metodologi Shaeffer - Fulton, juga dikenal sebagai Wirtz-Conklin.

Dari semua teknik yang disebutkan, metodologi Shaeffer-Fulton adalah yang paling banyak digunakan di makmal rutin. Ia dinamakan sempena dua ahli mikrobiologi yang mencipta pewarnaan pada tahun 1930: Alicia Shaeffer dan MacDonald Fulton. Walau bagaimanapun, teknik ini kadang-kadang dinamakan Wirtz-Conklin setelah dua ahli bakteriologi dari tahun 1900-an.

Asas

Spora tidak bernoda dengan noda konvensional kerana mempunyai dinding yang sangat tebal. Komposisi spora yang kompleks menghalang kemasukan kebanyakan pewarna.

Sekiranya spora dipelajari dari luar, lapisan berikut diperhatikan: pertama, terdapat exosporium, yang merupakan lapisan paling nipis dan luar yang terbentuk oleh glikoprotein.

Seterusnya muncul kutikula, yang memberikan ketahanan terhadap suhu tinggi, diikuti oleh korteks yang terdiri dari peptidoglikan. Nanti adalah dinding pangkalan yang melindungi protoplas.

Spora adalah struktur dehidrasi yang mengandungi 15% kalsium dan asid dipikolinik. Oleh itu, kebanyakan teknik pewarnaan spora bergantung pada penggunaan haba sehingga pewarna dapat menembusi struktur tebal.

Setelah spora diwarnai, ia tidak dapat menghilangkan pewarna. Dalam teknik Shaeffer - Fulton, hijau malachite memasuki sel vegetatif dan, apabila haba digunakan, menembusi endospora dan juga eksospora.

Dengan mencuci dengan air, pewarna dikeluarkan dari sel vegetatif. Ini berlaku kerana pewarna hijau malachite sedikit asas, jadi ia mengikat lemah ke sel vegetatif.

Sebagai gantinya, ia tidak dapat keluar dari spora dan akhirnya bacillus disatukan dengan safranin. Asas ini berlaku untuk teknik-teknik lain, di mana sesuatu yang serupa berlaku.

Teknik pewarnaan spora

Untuk melaksanakan pewarnaan spora, budaya murni strain mencurigakan yang harus dikaji mesti diperoleh.

Budaya ini mengalami suhu yang melampau selama 24 jam untuk merangsang mikroorganisma untuk membengkak. Untuk ini, kultur boleh diletakkan di dalam oven pada suhu 44 ° C atau di dalam peti sejuk (8 ° C) selama 24 atau 48 jam.

Sekiranya dibiarkan terlalu lama pada suhu yang disebutkan, hanya eksospora yang akan diperhatikan, kerana semua endospora sudah keluar dari basil.

Pada akhir masa, beberapa tetes larutan fisiologi steril harus diletakkan pada slaid yang bersih. Kemudian sebahagian kecil budaya diambil dan penyebaran halus dibuat.

Selepas itu, ia dibiarkan kering, tetap panas dan dicelup dengan salah satu teknik yang dijelaskan di bawah:

Teknik Dorner

1- Sediakan dalam tabung uji suspensi pekat mikroorganisma sporulasi dalam air suling dan tambahkan isi padu sama dengan Kinyoun carbol fuchsin yang ditapis.

2- Letakkan tiub di dalam tab mandi dengan air mendidih selama antara 5 hingga 10 minit.

3- Pada slaid bersih, campurkan setetes suspensi sebelumnya dengan setetes larutan nigrosin berair 10%, rebus dan tapis.

4- Sebarkan dan keringkan dengan cepat dengan api yang lembut.

5- Kaji dengan objektif 100X (rendaman).

Spora berwarna merah dan sel bakteria kelihatan hampir tidak berwarna dengan latar belakang kelabu gelap.

Teknik Dorner yang diubahsuai

1- Suspensi mikroorganisma sporulasi disebarkan pada slaid dan terpaku pada panas.

2- Sampel ditutup dengan jalur kertas penapis yang ditambahkan karbol fuchsin. Pewarna dipanaskan selama 5 hingga 7 minit dengan api pembakar Bunsen sehingga evolusi wap dihasilkan. Kemudian kertas itu dikeluarkan.

3- Penyediaannya dibasuh dengan air dan kemudian dikeringkan dengan kertas penyerap.

4- Tutup smear dengan lapisan tipis nigrosin 10%, menggunakan slaid kedua untuk menyebarkan nigrosin atau jarum.

Pewarnaan yang diambil oleh spora dan bakteria sama dengan yang dijelaskan dalam seni sebelumnya.

Shaeffer - Teknik Fulton atau Wirtz-Conklin

1- Buat smear halus dengan penggantungan mikroorganisma sporulasi pada slaid dan tahan hingga panas.

2- Tutup slaid dengan larutan berair hijau malachite 5% (anda boleh meletakkan kertas turas di slaid).

3- Panaskan di atas api pembakar Bunsen sehingga menyebabkan pelepasan wap dan nyalakan api. Ulangi operasi selama 6 hingga 10 minit. Sekiranya larutan hijau malachite menguap terlalu banyak semasa prosedur, lebih banyak boleh ditambah.

4- Keluarkan kertas turas (jika dipasang) dan basuh dengan air.

5- Tutup slaid dengan safranin berair 0.5% selama 30 saat (beberapa varian teknik menggunakan safranin berair 0.1% dan biarkan selama 3 minit).

Dengan teknik ini, spora kelihatan hijau dan bacilli merah.

Ia mempunyai kelemahan bahawa endospora budaya muda tidak ternoda dengan baik, kerana ia kelihatan sangat jelas atau tidak berwarna. Untuk mengelakkan ini, disarankan untuk menggunakan budaya inkubasi 48 jam.

Teknik Möeller

1- Tutup smear dengan kloroform selama 2 minit.

2- Buang kloroform.

3- Tutup dengan 5% asid kromik selama 5 minit.

4- Basuh dengan air suling

5- Lembaran ditutup dengan carbol fuchsin-fenicada dan terkena nyala api pembakar Bunsen sehingga mengeluarkan wap; kemudian dikeluarkan dari api selama beberapa saat. Operasi diulang sehingga 10 minit selesai.

6- Basuh dengan air.

7- Gunakan etanol berasid (alkohol hidroklorik) untuk menghilangkan warna. Ia dibiarkan selama 20 atau 30 saat.

8- Basuh dengan air suling.

9- Kontras dengan menutup lembaran dengan metilena biru selama 5 minit.

10- Basuh dengan air suling.

11- Biarkan sehingga kering dan sampel dibawa ke mikroskop.

Spora kelihatan merah dan bacilli berwarna biru. Penting untuk tidak menghirup wap, kerana ia beracun dan dalam jangka masa panjang boleh menjadi karsinogenik.

Teknik Möeller yang diubah suai tanpa panas

Pada tahun 2007 Hayama dan rakan-rakannya membuat pengubahsuaian teknik Möeller. Mereka menghilangkan langkah pemanasan pewarna dan menggantinya dengan menambahkan 2 tetes surfaktan Tergitol 7 untuk setiap 10 ml larutan carbol fuchsin-carbol. Hasil yang sama diperoleh.

Permohonan

Pewarnaan spora memberikan maklumat yang sangat berharga dan berguna untuk mengenal pasti patogen, kerana kehadirannya, bentuknya, lokasi di dalam basil dan kemampuan untuk mengubah bentuk sel vegetatif atau tidak, adalah data yang dapat memandu spesies terlibat dalam genre tertentu.

Dalam konteks ini, perlu dinyatakan bahawa spora boleh berbentuk bulat atau bujur, ia boleh terletak di tengah atau juga pada kedudukan paracentral, subminal atau terminal.

Rajah bentuk dan kedudukan endospora dan eksospora

Contoh

- Clostridium difficile membentuk spora bujur dalam kedudukan terminal yang mengubah bentuk basil.

- Spora Clostridium tertium berbentuk bujur, tidak merosakkan bacillus dan terletak di paras terminal.

- Endospora Clostridium tetani adalah terminal dan mencacatkan bacillus, memberikan penampilan batang drum.

- Spora Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy dan C. septicum adalah subterminal bulat atau bujur dan ubah bentuk bacillus.

- Endospora Clostridium sordelli terletak di kedudukan tengah, dengan sedikit ubah bentuk.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologi. (Edisi ke-5.) Argentina, Editor Panamericana SA

Rujukan

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Cadangan teknik yang dipermudahkan untuk mengotorkan spora bakteria tanpa menggunakan haba - berjaya mengubah suai kaedah Moeller. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Penyumbang Wikipedia. Noda Moeller. Wikipedia, Ensiklopedia Percuma. 3 November 2018, 03:28 UTC. Terdapat di: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual Makmal Teknik Mikrobiologi. Jabatan Sains Asas Akademi Mikrobiologi. Institut Politeknik Negara.
4. "Endospore." Wikipedia, Ensiklopedia Percuma. 25 Feb 2018, 10:20 UTC. 10 Jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J dan kolaborator. (2006). Kakitangan Buruh komuniti autonomi Extremadura. Agenda khusus Jilid IV. Editorial MAD. Seville-Spain, hlm 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) .Juruteknik makmal pakar, Perkhidmatan Kesihatan Galicia (SERGAS). Jilid agenda subjek tertentu 2. Editorial MAD. Seville-Spain, hlm 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologi. (Edisi ke-5.) Argentina, Editor Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Pengarang Panamericana SA