NODA ZIEHL-NEELSEN: RASIONAL, REAGEN, DAN TEKNIK - BIOLOGI - 2025

The Ziehl-Neelsen teknik pewarnaan untuk mengenal pasti asid alkohol tahan mikroorganisma (ARA). Nama prosedur mikrobiologi ini merujuk kepada pengarangnya: ahli bakteriologi Franz Ziehl dan ahli patologi Friedrich Neelsen.

Teknik ini adalah jenis pewarnaan pembezaan, yang menyiratkan penggunaan pewarna yang berbeza untuk mewujudkan kontras antara struktur yang ingin anda perhatikan, membezakan dan mengenal pasti kemudian. Noda Ziehl-Neelsen digunakan untuk mengenal pasti jenis mikroorganisma tertentu.

Noda Ziehl-Neelsen

Sebilangan organisma ini adalah mikobakteria (contohnya, Mycobacterium tuberculosis), nokardia (contohnya, Nocardia sp.), Dan beberapa parasit bersel tunggal (contohnya, Cryptosporidium parvum). Sebilangan besar bakteria dapat dikelaskan melalui teknik umum yang disebut noda Gram.

Walau bagaimanapun, beberapa kumpulan bakteria memerlukan kaedah lain untuk dapat mengenal pasti mereka. Teknik seperti noda Ziehl-Neelsen memerlukan kombinasi pewarna dengan haba untuk membetulkan bekas ke dinding sel.

Kemudian datang proses pemutihan yang memungkinkan untuk dua hasil: ketahanan atau kepekaan terhadap perubahan warna oleh asid dan alkohol.

Asas

Rasional teknik pewarnaan ini didasarkan pada sifat dinding sel mikroorganisma ini. Dindingnya terdiri daripada sejenis asid lemak yang disebut asid mikolik; Ini dicirikan oleh mempunyai rantai yang sangat panjang.

Apabila asid lemak mempunyai struktur yang sangat panjang, mereka dapat mengekalkan pewarna dengan lebih mudah. Beberapa genera bakteria sangat sukar untuk dicemari oleh noda Gram, kerana kandungan asid mikolik yang tinggi di dinding sel.

Noda Ziehl-Neelsen menggunakan fenol sebatian fenolik, noda asas. Ini mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan asid lemak pada dinding sel, yang bertekstur lilin pada suhu bilik.

Pewarnaan karbol fuchsin ditingkatkan dengan adanya panas, kerana lilin mencair dan molekul pewarna bergerak lebih cepat ke dinding sel.

Asid yang digunakan kemudiannya berfungsi untuk menghilangkan warna sel yang tidak bernoda kerana dindingnya tidak cukup berkaitan dengan pewarna; oleh itu, kekuatan peluntur asid mampu menghilangkan pewarna asid. Sel yang menahan perubahan warna ini dipanggil cepat asid.

Pewarna sekunder

Setelah penyahwarnaan sampel, ia dibezakan dengan pewarna lain yang disebut pewarna sekunder. Secara amnya, metilena biru atau malachite green digunakan.

Pewarna sekunder mengotorkan bahan latar dan seterusnya menimbulkan kontras dengan struktur yang diwarnai pada langkah pertama. Hanya sel yang berubah warna yang menyerap pewarna kedua (counterstain) dan mengambil warnanya, sementara sel yang cepat asid mengekalkan warna merahnya.

Prosedur ini sering digunakan untuk mengenal pasti Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae, yang disebut bacilli cepat asid.

Reagen

Pewarna primer

0,3% karbol fuchsin (disaring) digunakan. Pewarna ini disediakan dari campuran alkohol: fenol dalam etanol (90%) atau metanol (95%), dan dalam campuran ini 3 gram fuchsin asas dilarutkan.

Penyelesaian pemutihan

Dalam langkah ini, larutan asid alkohol 3% atau asid sulfurik 25% dapat digunakan.

Pewarna sekunder (pewarna kontra)

Pewarna yang paling banyak digunakan untuk membezakan sampel biasanya 0.3% biru metilena. Walau bagaimanapun, yang lain juga dapat digunakan, seperti 0,5% malachite green.

Teknik

Prosedur pewarnaan cepat asid

Sediakan smear bakteria

Penyediaan ini dilakukan pada slaid yang bersih dan kering, dengan langkah berjaga-jaga.

Pengeringan smear

Biarkan smear kering pada suhu bilik.

Panaskan sampel

Sampel hendaklah dipanaskan dengan menyalakan slaid di bawah. Fiksasi alkohol dapat dilakukan ketika smear belum disiapkan dengan dahak (dirawat dengan natrium hipoklorit untuk memutihkannya) dan jika tidak akan noda segera.

M. tuberkulosis dikeluarkan dengan peluntur dan semasa proses pewarnaan. Fiksasi haba sputum yang tidak dirawat tidak akan membunuh M. tuberculosis, sementara fiksasi alkohol bersifat bakteria.

Tutup noda

Noda ditutup dengan larutan karbol fuchsin (noda asas utama).

Panaskan noda

Ini dilakukan selama 5 minit. Anda harus melihat evolusi wap (kira-kira 60 ° C). Penting untuk tidak terlalu panas dan mengelakkan pembakaran sampel.

Berkenaan dengan pemanasan noda, berhati-hati harus dilakukan ketika memanaskan karbol fuchsin, terutama jika pewarnaan dilakukan di atas dulang atau bekas lain di mana bahan kimia yang sangat mudah terbakar dari pewarnaan sebelumnya telah dikumpulkan.

Hanya api kecil yang boleh digunakan di bawah gelongsor menggunakan penyapu yang sebelumnya menyala yang dibasahi dengan beberapa tetes alkohol berasid, metanol, atau 70% etanol. Elakkan menggunakan penyapu besar yang direndam dalam etanol kerana ini adalah bahaya kebakaran.

Basuh noda

Pencucian ini mesti dilakukan dengan air bersih. Sekiranya air paip tidak bersih, cuci smear dengan air yang disaring atau suling, lebih baik.

Tutup smear dengan alkohol asid

Alkohol asid ini mestilah pada kadar 3%. Liputan dilakukan selama 5 minit atau sehingga smear cukup berubah warna, iaitu warna merah jambu pucat.

Perlu diambil kira bahawa alkohol berasid mudah terbakar; oleh itu, ia mesti digunakan dengan berhati-hati. Elakkan berada di dekat sumber pencucuhan.

Basuh noda

Mencuci hendaklah menggunakan air suling yang bersih.

Tutup smear dengan noda

Ini boleh menjadi noda hijau malachite (0,5%) atau noda biru metilena (0,3%) selama 1 hingga 2 minit, menggunakan masa yang lebih lama jika smear nipis.

Basuh noda

Sekali lagi air bersih (suling) harus digunakan.

Untuk mengalirkan

Bahagian belakang slaid hendaklah dibersihkan dan noda diletakkan di rak saliran untuk membiarkannya kering (jangan gunakan kertas penyerap untuk pengeringan).

Kaji smear di bawah mikroskop

Objek 100X dan minyak rendaman mesti digunakan. Imbas smear secara sistematik dan catat pemerhatian yang berkaitan.

Tafsirkan hasilnya

Secara teorinya, mikroorganisma yang mengotorkan warna kemerahan dianggap positif cepat asid (AAR +).

Sebaliknya, jika mikroorganisma berwarna biru atau hijau, bergantung pada pewarna yang digunakan sebagai pewarna kontra, ia dianggap negatif cepat cepat (AAR-).

Rujukan

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Keperluan Mikrobiologi Praktikal (edisi pertama). Penerbit Perubatan Jaypee Brothers.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologi dengan Penyakit oleh Sistem Tubuh (edisi ke-4). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Mikrobiologi Pengenalan (edisi pertama). Akhbar Universiti Cambridge.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Manual Makmal dan Buku Kerja dalam Mikrobiologi: Aplikasi untuk Penjagaan Pesakit (edisi ke-11). Pendidikan McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Buku Teks Mikrobiologi (edisi pertama). PVT Penerbitan BI.