NODA GRAM: RASIONAL, BAHAN, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2024

The Gram noda adalah yang paling mudah dan paling berguna mengotorkan teknik dalam bidang mikrobiologi diagnostik. Teknik ini diciptakan oleh doktor Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884, yang berjaya mengklasifikasikan bakteria sebagai Gram positif dan Gram negatif, menurut komposisi dinding sel.

Teknik ini mengalami pengubahsuaian tertentu oleh Hucker pada tahun 1921 untuk menstabilkan reagen dan meningkatkan kualiti pewarnaan, itulah sebabnya noda Gram juga dikenal sebagai Gram-Hucker.

Pelbagai smear berwarna dengan noda Gram. A. Gram positif cocci. B. Batang negatif gram. C. Bakil polimorfonuklear dan mononuklear positif gram. D. Ragi.

Dengan teknik ini juga memungkinkan untuk melihat bentuk mikroorganisma, iaitu, antara lain, cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorphic, filamen. Serta pengedarannya di ruang angkasa: dalam kelompok, dalam rantai, terpencil, berpasangan, dalam tetrad, dll.

Apabila disyaki jangkitan bakteria, kebanyakan sampel yang diterima harus dioleskan pada slaid dan Gram diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik.

Laporan Gram akan membimbing doktor mengenai jenis mikroorganisma apa yang menjadi penyebab jangkitan, sebelum mendapatkan hasil kultur akhir.

Dalam beberapa kes, kehidupan pesakit sangat terganggu, oleh itu doktor sangat memerlukan laporan Gram untuk melakukan rawatan empirik, sementara mereka menunggu pengenalan mikroorganisma.

Sebagai contoh, jika Gram mendedahkan bahawa terdapat cocc Gram positif dalam cecair serebrospinal, doktor akan membimbing terapi awal dengan antibiotik yang menghilangkan bakteria jenis ini, menurut protokol yang ditetapkan untuk ini.

Setelah keputusan akhir tiba dengan nama mikroorganisma terpencil dan antibiogramnya masing-masing, doktor akan menilai sama ada akan mengubah terapi atau tidak. Keputusan ini akan dibuat sesuai dengan kajian kerentanan mikroorganisma terhadap antibiotik yang diterimanya dan evolusi pesakit.

Asas

Ini adalah teknik yang mempunyai 4 langkah asas: pewarnaan, fiksasi dengan mordant, perubahan warna dan penghitungan. Oleh itu, teknik ini, selain mewarnai bakteria, juga memungkinkan mereka dibezakan.

Crystal violet adalah pewarna pertama yang digunakan. Ini mempunyai pertalian untuk peptidoglikan dan akan mengotorkan semua bakteria yang ada ungu, kemudian lugol diletakkan, yang bertindak sebagai mordant, iaitu, ia akan mendorong pembentukan kompleks violet-yodium kristal yang tidak larut - protein ribonuklear di dalam sel. .

Bakteria gram positif, yang mempunyai dinding peptidoglikan tebal, membentuk lebih banyak kompleks (kristal violet-yodium), oleh itu mereka mengekalkan pewarna.

Di samping itu, ia juga mempengaruhi bahawa dinding bakteria Gram positif mengandungi jumlah asid tak jenuh yang lebih banyak, yang menunjukkan pertalian yang besar untuk agen pengoksidaan (Lugol).

Sementara itu, bakteria Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, yang menyebabkan bakteria tersebut kurang membentuk kompleks daripada bakteria Gram positif.

Kemudian datang langkah perubahan warna, di mana bakteria Gram positif dan Gram negatif berkelakuan berbeza.

Bakteria gram negatif mengandungi selaput luar yang kaya dengan lipopolisakarida yang merupakan bahagian dinding sel mereka. Lemak dihancurkan oleh sentuhan dengan alkohol aseton, sehingga membran luar menjadi tidak stabil, melepaskan kristal ungu.

Ini adalah bagaimana ia kemudian dilawan dengan safranin atau fuchsin asas, menjadi merah.

Dalam kes bakteria Gram positif, mereka menolak pudar kerana pemutihan berfungsi dengan menutup liang-liang, mencegah kompleks violet kristal / yodium keluar.

Oleh itu, pewarnaan dengan kristal ungu tetap stabil, dan tidak ada ruang untuk safranin atau fuchsin. Inilah sebabnya mengapa bakteria ini berwarna biru tua atau ungu.

bahan

Set pewarnaan Gram terdiri daripada:

• Kaca ungu
• Lugol
• Alkohol aseton
• Safranin atau fuchsin asas

Penyediaan pewarna dan reagen

Penyelesaian violet kristal

Penyelesaian untuk:

Kristal ungu ------------- 2 gr

Etil alkohol 95% ----------- 20cc

Penyelesaian B:

Ammonium oksalat ----------- 0,8 gr

Air suling ------------- 80 cc

Untuk penyediaan akhir violet kristal, larutan A mesti dicairkan 1:10 dengan air suling dan dicampurkan dengan 4 bahagian larutan B. Campuran disimpan selama 24 jam sebelum digunakan. Tapiskan ke dalam botol pewarna ambar dengan menggunakan kertas turas.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari dipindahkan ke botol penitis ambar.

Iodo-Lugol

Timbang dan ukur jumlah yang ditunjukkan bagi setiap sebatian, seperti berikut:

Kristal yodium ------------- 1gr

Kalium iodida ------------- 2gr

Air suling ------------- 300 cc

Kalium iodida larut sedikit demi sedikit di dalam air dan kemudian yodium ditambahkan. Penyelesaiannya dicukur ke dalam botol ambar.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari dipindahkan ke botol ambar yang lebih kecil dengan penetes.

Pemutihan

95% Etil Alkohol -----------– 50 ml

Aseton ------------------ 50 ml

Ia disediakan dalam bahagian yang sama. Tutup dengan baik, kerana cenderung menguap.

Letakkan di dalam botol penitis.

Penyediaan ini memberikan perubahan warna dalam masa sederhana 5-10 saat dan paling digalakkan.

Pemula lebih suka menggunakan etil alkohol 95% sahaja, di mana pudar lebih perlahan daripada 10 hingga 30 saat.

Walaupun yang lebih berpengalaman boleh menggunakan aseton tulen, di mana perubahan warna berlaku dengan cepat dari 1 hingga 5 saat.

Kontras

Penyelesaian Saham Safranin

Safranina -------------– 2.5 gr

Etil alkohol 95% --------– 100 cc

Setelah menimbang jumlah safranin yang ditunjukkan, ia dilarutkan dalam 100 ml etil alkohol 95%.

Penyelesaian safranin yang berfungsi disediakan dari larutan stok.

Untuk melakukan ini, ukur 10 cc larutan stok, tambahkan 90 cc air suling untuk membuat 100 ml.

Sebaiknya pindahkan jumlah yang akan digunakan setiap hari ke botol kuning dengan penetes.

Mikroorganisma yang lemah noda Gram negatif dengan noda Gram-Hucker, seperti anaerob tertentu, Legionella sp, Campylobacter sp, dan Brucella sp, dapat diwarnai dengan lebih baik dengan menggunakan modifikasi Kopeloff dari noda Gram-Hucker, dipanggil noda Gram-Kopeloff.

Teknik ini mengubah pewarna safranin menjadi fuchsin asas. Dengan pengubahsuaian ini dapat mewarnai mikroorganisma yang disebutkan di atas dengan berkesan.

Penyimpanan reagen

Pewarna yang siap hendaklah disimpan pada suhu bilik.

Penyediaan smear sampel yang akan diwarnakan

Sampel mesti mengandungi sekurang-kurangnya 10 ⁵ mikroorganisma sebelum kemungkinan pemerhatian mikroorganisma dalam smear. Smear boleh dibuat dari sampel langsung atau dari kultur dalam media pepejal atau cecair.

Smear harus seragam, diedarkan dengan baik dan tidak terlalu tebal, untuk visualisasi struktur yang ada dengan lebih baik.

-Gram sampel langsung

Gram air kencing yang tidak berpusat

Air kencing dicampurkan dan 10 µl diletakkan di atas slaid. Pemerhatian sekurang-kurangnya satu bakteria / bidang Dip menunjukkan bahawa terdapat jangkitan.

Ini bermakna bahawa kultur akan mempunyai lebih daripada 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) air kencing dalam 85% kes.

Kaedah ini tidak berguna untuk jumlah koloni di bawah 100,000 CFU.

Gram CSF

CSF harus disentrifugasi, supernatan dikeluarkan, dan pelet tersebar di slaid. Cecair ini steril dalam keadaan normal; pemerhatian bakteria menunjukkan jangkitan.

Gram sampel pernafasan

Gram sputum, bronkus bronkus atau bronchoalveolar, walaupun mungkin terdapat pelbagai mikroorganisma, akan selalu memandu diagnosis, selain berguna untuk jenis sel yang diperhatikan.

Sekiranya dahak, smear harus disiapkan dengan bahagian sampel yang paling bernanah.

Gram najis

Tidak disarankan untuk melakukan Gram pada jenis sampel ini, kerana tidak mempunyai nilai diagnostik.

-Grama tanaman

Mereka boleh dilakukan dengan dua cara, satu dari kultur cair dan yang lain dari kultur padat.

Budaya cecair

Dari kultur cecair sangat sederhana; Beberapa panggang kaldu mendung diambil di bawah pembakar dan diletakkan di atas gelongsor yang bersih dan kering, membuat pergerakan bulat dari pusat ke pinggir, untuk mengedarkan bahan secara merata.

Biarkan kering secara spontan di udara. Setelah kering, bahan tersebut dilekatkan pada kepingan dengan panas. Untuk melakukan ini, dengan bantuan pinset, lembaran disalurkan 3 hingga 4 kali melalui api pembakar Bunsen, dengan berhati-hati agar tidak membakar bahan tersebut.

Lembaran dibiarkan sejuk dan diletakkan di atas jambatan pewarna.

Tanaman pepejal

Untuk melakukan smear untuk noda Gram dari budaya yang padat, lakukan seperti berikut:

Sebelum memilih koloni yang akan diambil, slaid harus disediakan, meletakkan kira-kira dua tetes larutan garam fisiologi steril.

Sekiranya plat budaya asli mengandungi beberapa jenis koloni yang berlainan, masing-masing koloni terpencil akan dipilih untuk melakukan Gram. Setiap koloni akan dibawa dengan gelung platinum untuk larut dalam larutan garam yang sebelumnya diletakkan di atas slaid.

Pergerakan pekeliling dibuat dari pusat ke pinggir, untuk menyebarkan koloni secara homogen pada slaid.

Biarkan kering secara spontan di udara. Setelah kering, pasangkan lembaran dengan api, seperti yang dijelaskan sebelumnya (nyalakan slaid dengan pemetik api), berhati-hati agar tidak membakar bahan tersebut.

Prosedur ini mesti dilakukan dengan setiap jenis jajahan yang berbeza. Pada sehelai kertas, urutan apa yang diperhatikan harus diperhatikan, misalnya:

Koloni 1: Koloni kuning beta-hemolitik: Gram positif cocci diperhatikan dalam kelompok

Koloni 2: Koloni berwarna krim, tanpa hemolisis: Coccobacilli negatif gram diperhatikan.

Setiap slaid mesti dilabel untuk mengetahui apa yang kita perhatikan.

Teknik

Teknik pewarnaan Gram sangat mudah dilakukan dan agak murah dan tidak boleh dilewatkan di makmal mikrobiologi.

Ia dilakukan seperti berikut:

1. Betulkan smear dengan api dan letakkan di jambatan pewarnaan.
2. Tutup slaid sepenuhnya dengan violet kristal selama 1 minit.
3. Basuh dengan air Jangan keringkan
4. Tutup lembaran dengan larutan lugol, biarkan selama 1 minit. Basuh dengan air Jangan keringkan.
5. Pemutihan selama 5-10 saat dengan goncangan lembut dalam aseton alkohol. Atau, letakkan lembaran pada kedudukan menegak dan turunkan titisan dekolorizer di permukaan sehingga lebihan kaca violet yang tidak dilepaskan dikeluarkan. Jangan melebihi.
6. Basuh dengan air Jangan keringkan.
7. Gantikan slaid di jambatan pewarnaan dan tutup selama 30 saat dengan safranin (Gram-Hucker) atau 1 minit dengan fuchsin asas (Gram-Kopeloff).
8. Basuh dengan air
9. Biarkan udara kering secara spontan dalam kedudukan tegak.

Setelah kering, letakkan 1 tetes minyak rendaman untuk memerhatikannya di bawah objektif 100X dalam mikroskop cahaya.

Utiliti

Teknik ini memungkinkan untuk membezakan perbezaan morfotintorial kebanyakan bakteria.

Ragi juga dibezakan dengan pewarnaan ini. Mereka mengambil violet kristal, iaitu, mereka mengotorkan Gram positif.

Sebaliknya, basil Gram-positif yang membentuk spora dapat dibezakan, di mana ruang yang jelas diperhatikan di dalam bacillus, di mana endospora terbentuk, walaupun spora tidak bernoda dengan baik. Teknik lain seperti Shaeffer-Fulton digunakan untuk mengotorkan spora.

Harus diingat bahawa pewarnaan ini tidak digunakan untuk mewarnai semua jenis bakteria, yaitu, ada kes di mana pewarnaan tidak berfungsi.

Dalam kes ini bakteria yang kekurangan dinding sel dapat disebutkan. Contohnya: genus Mycoplasma, sferoplas, ureaplasma, L-bentuk dan protoplas.

Ia juga mengotorkan bakteria dengan dinding yang kaya dengan asid mikolat, seperti Mycobacteria, dan bakteria intraselular seperti Chlamydias dan Rickettsias.

Ia juga tidak berkesan untuk mengotorkan bakteria spirochetal.

Terdapat bakteria genus yang sama yang dapat diperhatikan dalam sampel yang sama dengan Gram positif dan Gram negatif. Apabila ini terjadi, ia disebut variabel Gram stain, yang dapat disebabkan oleh perubahan nutrien, suhu, pH atau kepekatan elektrolit.

Kesalahan biasa

Pelunturan berlebihan

Berlebihan dalam langkah perubahan warna dapat menyebabkan pemerhatian mikroorganisma negatif Gram palsu.

Tidak menunggu masa pengeringan yang cukup lama untuk menambahkan minyak rendaman

Ia boleh menyebabkan bakteria Gram positif mengotorkan Gram negatif (Gram negatif palsu). Ini berlaku kerana dalam budaya lama kemungkinan ada bakteria yang mati atau manja dan dalam keadaan ini bakteria tidak mengekalkan violet kristal.

Gunakan penyelesaian lugol yang sangat lama:

Lama-kelamaan lugol kehilangan sifatnya dan warnanya semakin pudar. Sekiranya reagen yang sudah merosot digunakan, ia tidak akan memperbaiki violet kristal dengan baik, oleh itu ada kemungkinan memperoleh visualisasi mikroorganisma negatif Gram palsu.

Latar belakang biru

Latar belakang yang berubah warna akan berwarna merah. Latar belakang biru menunjukkan bahawa perubahan warna tidak mencukupi.

Rujukan

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Mikrobiologi Perubatan, edisi ke-6 McGraw-Hill, New York, Amerika Syarikat
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologi. (Edisi ke-5.) Argentina, Editor Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Pengarang Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Mikologi Umum. Edisi ke-2 Universiti Pusat Venezuela, Edisi Perpustakaan. Venezuela Caracas.
5. "Noda Gram." Wikipedia, Ensiklopedia Percuma. 4 Okt 2018, 23:40 UTC. 9 Dis 2018, 17:11. Diambil dari es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual Mikrobiologi Perubatan. Edisi ke-2, Venezuela: Direktorat media dan penerbitan Universiti Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Noda asas di makmal mikrobiologi. Penyelidikan Ketidakupayaan. 2014; 3 (1): 10-18.